水溶性茯苓多糖PWP-Y提取工藝優(yōu)化及其分子量測定的研究

趙小龍，楊　濤，湯　進， 陳　平

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023 )

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水溶性茯苓多糖PWP-Y提取工藝優(yōu)化及其分子量測定的研究

趙小龍，楊濤，湯進， 陳平

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023 )

摘要：優(yōu)化水溶性茯苓多糖PWP-Y的提取工藝條件，純化并測定其分子量。采用正交試驗設計，考察超聲時間、料液比、提取溫度和提取時間等條件對多糖得率的影響，得出最優(yōu)工藝參數(shù)；采用Sevage法脫蛋白、H2O2脫色素、TSKgel PW-M兩柱串聯(lián)色譜柱分離純化得到均一的茯苓多糖PWP-Y；利用Waters 2414示差檢測器聯(lián)用Wyatt HELEOS-Ⅱ多角度激光光散射檢測器，對多糖的絕對分子量和表征進行測定。 結(jié)果表明：提取多糖的最佳工藝組合為A1B3C3D3，即超聲時間為30 min，料液比為1∶50，提取溫度為100 °C，提取時間為4 h，提取效率為5.62%；茯苓多糖PWP-Y由小分子和大分子2個組分構(gòu)成，Mw分別為39.3×103、54.3×105，其空間構(gòu)象為團狀。

關(guān)鍵詞：茯苓多糖；提取優(yōu)化；分子量測定；多糖構(gòu)象

1引言

茯苓(Wolfiporiacocos)隸屬于擔子菌門，多孔菌科，茯苓屬[1]，是一種高等擔子菌，多以菌核入藥。其味甘、淡、平，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有利水滲濕，健脾寧心的功效。用于水腫尿少，痰飲眩悸，脾虛食少，便溏泄瀉，心神不安，驚悸失眠[2]，是一種珍貴的食藥兼用藥材。茯苓多糖(Pachymose)作為茯苓的主要活性成分，具有提高人體免疫機能、抗炎、防止腫瘤等功效[3-4]，能夠廣泛用于食品、醫(yī)療保健等領域。

為提高茯苓多糖的提取效率，本實驗在以超聲時間、料液比、提取溫度、提取時間4個單因素為考察指標的基礎上，利用正交試驗設計優(yōu)化了茯苓多糖的最佳提取工藝條件；采用Waters 2414示差檢測器聯(lián)用Wyatt HELEOS-Ⅱ多角度激光光散射檢測器對茯苓多糖PWP-Y的絕對分子量和其空間構(gòu)象進行了測定與表征。

2材料與方法

2.1材料與試劑

茯苓采自湖北英山，為多孔菌科真菌茯苓(PoriacocosF.A.Wolf)的干燥菌核，干燥、粉碎后備用。

葡萄糖標準品制備：精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖1 g，加適量水溶解，定量轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。

6 %苯酚：取6 g苯酚加熱溶解，定容至100 mL容量瓶中，4 ℃下避光保存。

2.2方法

2.2.1茯苓多糖的提取與分離純化

粉碎的茯苓粉磨過60目篩，加入80%乙醇，70 ℃回流提取2 h，重復2次后用60 ℃水再提取3次。在提取的茯苓多糖液體中加入三氯甲烷∶正丁醇(5∶1)60 mL，振搖30 min，靜置過夜，棄去有機層，收集水層，3 000 r/min離心10 min；取上清液濃縮至約15 mL左右，加入 95 %乙醇至乙醇濃度達到 85 %，4 ℃過夜，棄去上清液，揮去乙醇，殘渣在 60 ℃下恒溫干燥，即得茯苓水溶性多糖樣品。

2.2.2供試品溶液的制備

精密稱取各樣品粉末約0.012 5 g，加適量水溶解，定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，搖勻備用。

2.2.3標準曲線的繪制

分別量取0 mL，2.0 mL，4.0 mL，6.0 mL，8.0 mL，10.0 mL葡萄糖標準溶液(1 g/L)到100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，各取1 mL加入試管中，依次加入0.5 mL 6% 苯酚溶液和2.5 mL濃硫酸，搖勻，冷卻至室溫后于490 nm處測吸光值。以吸光度A為縱坐標，標準液濃度C(mg/mL)為橫坐標，得到葡萄糖溶液標準曲線回歸方程為A=14.5250C+0.0599(R2=0.9996)。結(jié)果如表1，圖1所示。

表1葡萄糖標準曲線數(shù)據(jù)

實驗組12345C/(mg/mL)0.020.040.060.080.1A0.3620.6290.9241.2261.516

圖1　葡萄糖標準曲線

2.2.4茯苓多糖含量的測定[5-6]

配制一定濃度的多糖樣品溶液，取各樣品溶液100 uL于具塞試管中，依次加入0.9 mL蒸餾水，0.5 mL 6%苯酚，2.5 mL濃硫酸，搖勻。將試管于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻5 min后放入冷水浴中15 min，在490 nm處測定各樣品溶液的吸光度值。將吸光度值代入標準曲線回歸方程為A=14.5250C+0.0599(R2=0.9996)中，即可算出所配置多糖樣品溶液的濃度。

多糖含量(%)=(多糖溶液×稀釋倍數(shù)×

多糖溶液體積/樣品質(zhì)量)×100% .

2.2.5單因素實驗

在大量實驗過程中發(fā)現(xiàn)，水溶性茯苓多糖的提取受到很多因素的影響，比如超聲時間、提取時間、提取溫度及料液比等，故對這些影響因素進行了具體研究。

2.2.6正交試驗方案

在單因素實驗基礎上，選擇超聲時間、料液比、提取時間、提取溫度4個因素[7-8]，通過比較多糖提取率來確定最佳提取工藝。以考察多糖含量為指標，選擇 L9(34)正交表進行實驗。

多糖提取率(%)=(多糖含量/藥材質(zhì)量)×100%.

2.2.7多糖PWP-Y平均分子量的測定及空間構(gòu)象表征

以優(yōu)化的提取工藝為基礎，提取與分離純化得到多糖PWP-Y。選用TSKgelPW-M兩柱串聯(lián)作為色譜柱，0.7%硫酸鈉作為流動相，采用Waters 2414示差檢測器聯(lián)用Wyatt HELEOS-Ⅱ多角度激光光散射檢測器對茯苓多糖PWP-Y的絕對分子量和其空間構(gòu)象進行測定與表征。

3結(jié)果與分析

3.1單因素實驗

3.1.1提取時間對水溶性多糖提取率的影響

稱取5.0 g茯苓粉5份分別置于5個250 mL的圓底燒瓶中，按照料液比1∶20分別加入100 mL蒸餾水，搖勻，超聲20 min后放入90 ℃的恒溫水浴中分別反應1 h，2 h，3 h，4 h，5 h。冷卻至室溫后過濾，收集濾液，4 ℃避光保存。

分別取濾液0.5 mL，用蒸餾水補至1.0 mL，各加入0.5 mL苯酚和2.5 mL濃硫酸，搖勻，冷卻15 min后，用紫外可見分光光度計于490 nm波長下，測得五組吸光值，根據(jù)公式求出多糖提取率，對提取時間做圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1　提取時間對水溶性多糖提取率的影響

由圖1可知，反應時間在4 h時提取出的茯苓水溶性多糖量最多，選擇3 h，4 h，5 h為提取時間因素的三水平。

3.1.2提取溫度對水溶性多糖提取率的影響

稱取5.0 g茯苓粉5份分別置于5個250 mL的圓底燒瓶中，按照料液比1∶20分別加入100 mL蒸餾水，搖勻，超聲20 min后分別放入60 ℃，70 ℃，80 ℃，90 ℃，100 ℃ 的恒溫水浴中分別反應4 h。冷卻至室溫后過濾，收集濾液，4 ℃避光保存。

分別取濾液0.5 mL，用蒸餾水補至1.0 mL，各加入0.5 mL苯酚和2.5 mL濃硫酸，搖勻，冷卻15 min后，用紫外可見分光光度計于490 nm波長下，測得五組吸光值，根據(jù)公式求出多糖提取率，對提取溫度做圖，結(jié)果如圖2所示。

圖2　提取溫度對水溶性多糖提取率的影響

由圖2可知，提取溫度在100 °C提取出的茯苓水溶性多糖量最多，選擇80 ℃，90 ℃，100 ℃為提取溫度因素的三水平。

3.1.3料液比對水溶性多糖提取率的影響

稱取5.0 g茯苓粉5份分別置于5個圓底燒瓶中，分別按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入蒸餾水，搖勻，超聲20 min后分別放入100 ℃ 的恒溫水浴中分別反應4 h。冷卻至室溫后過濾，收集濾液，4 ℃避光保存。

分別取濾液0.5 mL，用蒸餾水補至1.0 mL，各加入0.5 mL苯酚和2.5 mL濃硫酸，搖勻，冷卻15 min后，用紫外可見分光光度計于490 nm波長下，測得五組吸光值，根據(jù)公式求出多糖提取率，對料液比做圖，結(jié)果如圖3所示。

圖3　料液比對水溶性多糖提取率的影響

由圖3 可知，在料液比1∶20之后，多糖提取率隨料液比增大而變化不明顯，為了節(jié)約資源，選取1∶20、1∶30、1∶40為料液比因素的三水平。

3.1.4超聲時間對水溶性多糖提取率的影響

稱取5.0 g茯苓粉5份分別置于5個250 mL圓底燒瓶中，按照料液比1∶30加入蒸餾水，搖勻，分別超聲10 min，20 min，30 min，40 min，50 min后放入100 ℃ 的恒溫水浴中分別反應4 h。冷卻至室溫后過濾，收集濾液，4 ℃避光保存。

分別取濾液0.5 mL，用蒸餾水補至1.0 mL，各加入0.5 mL苯酚和2.5 mL濃硫酸，搖勻，冷卻15 min后，用紫外可見分光光度計于490 nm波長下，測得五組吸光值，根據(jù)公式求出多糖提取率，對超聲時間做圖，結(jié)果如圖4所示。

圖4　超聲時間對水溶性多糖提取率的影響

由圖4 可知，超聲時間在30 min時，茯苓多糖提取率最大，因此選擇20 min，30 min，40 min為超聲時間因素的三水平。

3.2提取條件工藝優(yōu)化

根據(jù)以上單因素實驗，選擇超聲時間、料液比、提取時間、提取溫度4個因素，以考察多糖含量為指標，選擇 L9(34)正交表進行實驗，見表2。正交試驗結(jié)果見表3。

表2正交試驗的因素水平表

水平因素(A)超聲時間/min(B)料液比(C)提取溫度/℃(D)提取時間/h1301∶308022401∶409033501∶501004

表3正交試驗結(jié)果

試驗號超聲時間(A)料液比(B)提取溫度(C)提取時間(D)提取率/%111114.28212224.29313335.62421234.02522314.97623124.32731324.71832133.84933214.57K114.1913.0112.4413.82K213.3113.1012.8813.32K313.1214.5115.3013.48k14.734.344.154.61k24.444.374.294.44k34.374.845.104.49R0.360.500.950.17主次順序C>B>A>D優(yōu)水平A1B3C3D1優(yōu)組合A1B3C3D1

表3顯示 ，由K值可以確定各因素的最優(yōu)水平是A1, B3, C3, D1，由極差R值可知，各因素對多糖提取率的影響次序為：提取溫度>料液比>超聲時間>提取時間，由此可見反應溫度對水溶性多糖提取率影響最大。由正交結(jié)果分析茯苓水溶性多糖的最佳提取條件為：A1B3C3D1，即：超聲時間30 min，料液比1∶50，提取溫度100 ℃，提取時間2 h。

3.3PWP-Y分子量的測定及空間構(gòu)象[9-10]

由于多角度激光光散射法不需要分子量系列標準品就可以測出多糖的絕對分子量，可以免去分子量對照品與待測物質(zhì)物理、化學性質(zhì)不同的誤差，為測量多糖的分子量帶來了極大的便利，分子量大小如表4、圖5所示。采用Waters 2414示差檢測器聯(lián)用Wyatt HELEOS-Ⅱ多角度激光光散射檢測器測定樣品的絕對分子量和R.M.S值，即樣品的均方旋轉(zhuǎn)半徑，我們以樣品的重均分子量和R.M.S做一條直線，其斜率可以對樣品的空間構(gòu)象進行表征。結(jié)果見圖6、表5。

表4茯苓多糖PWP-Y重均分子量結(jié)果表

組分1(kD)組分2(kD)Mw10%小分子10%大分子Mw10%小分子10%大分子5425.91338.315992.239.315.775.2

圖5　茯苓多糖PWP-Y色譜圖

圖6　茯苓多糖PWP-Y構(gòu)象圖

表5茯苓多糖PWP-Y構(gòu)象結(jié)果表

提取方式斜率構(gòu)象水提0.37團狀

由表4和圖5可知，茯苓多糖PWP-Y由2個組分構(gòu)成，經(jīng)過儀器分別對各組分分子量進行測定統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)小分子部分(組分2)占到茯苓多糖總含量的80%以上；由表5和圖6可知，茯苓多糖PWP-Y的空間構(gòu)象顯示為團狀，多糖空間構(gòu)象也與其來源及提取工藝息息相關(guān)。

4結(jié)論與討論

由以上實驗結(jié)果可知，茯苓多糖最佳的提取工藝條件為超聲時間30 min，料液比1∶50，提取溫度100℃，提取時間4 h。本實驗是在超聲輔助的基礎上采用熱水提取法，通過正交試驗對水溶性茯苓多糖的提取工藝進行了優(yōu)化，獲取了最佳提取工藝。但是經(jīng)過優(yōu)化后的工藝提取率仍然很低，經(jīng)查閱的文獻上報道運用微波、酶法等方法提取水溶性茯苓多糖的得率也不高，制約了茯苓水溶性多糖的進一步研究、應用和工業(yè)化生產(chǎn)，因此考慮利用其他提取方法來獲得更高的提取率。

Wyatt HELEOS-Ⅱ多角度激光光散射檢測器除了可測定高聚物的絕對分子量和分子大小，對其結(jié)構(gòu)進行研究和表征外，更重要的是也可以進行實時監(jiān)測：通過檢測聚合物溶液的穩(wěn)定過程，可進行降解、聚集及相分離過程的動力學和機械性能研究；通過檢測聚合反應過程，可感知產(chǎn)品經(jīng)加熱、輻射、酸處理，或添加其他助劑以后，體系如何達到穩(wěn)定，從而進行質(zhì)量控制。

由Waters 2414示差檢測器聯(lián)用Wyatt HELEOS-Ⅱ多角度激光光散射檢測器測定的茯苓多糖PWP-Y由小分子跟大分子2個組分構(gòu)成，空間構(gòu)象顯示為致密團狀，這可能導致該多糖作為保健品進入人體后很難被吸收，為以后該多糖的開發(fā)利用奠定了理論基礎。

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Optimization of extraction process and molecular weight determination of pachymose from poria cocos

ZHAOXiao-long，YANGTao，TANGJin，CHENPing

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：To optimize polysaccharide extraction technology of water soluble poria cocos, purification and determination of the molecular weight. Orthogonal experimental design was used to study the optimum polysaccharides extraction condition. Ultrasonic time, solid-liquid ratio, extraction temperature and extraction time were selected to conduct single factor test; The Sevage method was used for deproteinization, H2O2 was used for depigmentation. The polysaccharide PWP-Y was purified by TSKgel PW-M chromatographic column; Waters 2414 differential detector combination Wyatt HELEOS-Ⅱmulti-angle laser light scattering were both applied in the determination of the relative molecular weight(Mw) and characterization of polysaccharides. Results show that the optimum conditions of polysaccharide extraction was A1B3C3D3, when the ultrasonic time, material liquid ratio, extraction temperature and extracting time were 30min, 1∶50, 100 ℃ and 4 h，the extraction efficiency would reach 5.62%; Polysaccharide PWP-Y was made up of micromolecule and macromolecular two components, which Mw was 39.3×103 and 54.3×105, respectively. The spatial conformation of PWP-Y shows clumps.

Key words：pachymaran；optimization of extraction；determination of molecularweight；polysaccharide conformation

中圖分類號：TQ 464

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.01.008

文章編號：2095-7386(2016)01-0034-05

基金項目：國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201107009).

作者簡介：趙小龍(1990-)，男，碩士研究生，E-mail：a87635263@qq.com.通信作者：陳平(1958-)，女，教授，E-mail：chenpingvip24@163.com.

收稿日期：2015-11-04.