果葡糖漿生產(chǎn)過(guò)程中常見(jiàn)污染微生物的鑒定

李存治，毛靈琪，閆達(dá)中

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

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果葡糖漿生產(chǎn)過(guò)程中常見(jiàn)污染微生物的鑒定

李存治，毛靈琪，閆達(dá)中

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

摘要：針對(duì)某企業(yè)生產(chǎn)的果葡糖漿在生產(chǎn)過(guò)程中出現(xiàn)的產(chǎn)品微生物污染情況，通過(guò)對(duì)生產(chǎn)果葡糖漿的不同環(huán)節(jié)取樣進(jìn)行微生物檢測(cè)，對(duì)主要污染菌進(jìn)行16S rDNA或26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析比對(duì)，鑒定為桿菌和酵母。通過(guò)污染微生物鑒定結(jié)果，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中的情況，從不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)入手，最后確定出污染源，從而為有效地控制生產(chǎn)工藝過(guò)程中潛在的微生物危害提供幫助。

關(guān)鍵詞：果葡糖漿；污染源分析；菌種鑒定；桿菌；酵母

1引言

果葡糖漿是以酶法糖化淀粉得到的糖化液，經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的作用后，將其中的部分葡萄糖異構(gòu)成果糖[1]。隨著國(guó)內(nèi)市場(chǎng)對(duì)果葡糖漿需求的不斷增加，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量要求也不斷提高。為了保證食品安全，我國(guó)質(zhì)量監(jiān)督管理部門(mén)和企業(yè)品質(zhì)控制部門(mén)需要經(jīng)常對(duì)各種產(chǎn)品進(jìn)行微生物的檢測(cè)，以防止變質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)入流通領(lǐng)域。如果在生產(chǎn)過(guò)程控制不當(dāng)，或者管道使用時(shí)間較長(zhǎng)沒(méi)有及時(shí)清理，就會(huì)出現(xiàn)批量微生物污染現(xiàn)象，造成巨大損失。因此，在生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)污染產(chǎn)品的微生物進(jìn)行快速鑒定，進(jìn)而判斷出污染來(lái)源顯得非常重要。在實(shí)際生產(chǎn)中，可定期對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行取樣檢測(cè)，研究樣品中污染微生物的種類(lèi)及其生長(zhǎng)、分布特性，根據(jù)其表型特征從而進(jìn)行分類(lèi)，或者利用其基因型(特別是rDNA)的序列分析和比對(duì)，鑒定出污染微生物的種類(lèi)，從而及時(shí)、有效地幫助企業(yè)消除污染源頭、阻斷污染途徑或調(diào)整殺菌工藝，這對(duì)生產(chǎn)廠家阻斷微生物的污染途徑，設(shè)計(jì)并改良生產(chǎn)工藝，以及加強(qiáng)生產(chǎn)過(guò)程管理具有重要的意義[2-4]。果葡糖漿的生產(chǎn)工藝主要經(jīng)過(guò)以下步驟流程：淀粉→液化→糖化→過(guò)濾→脫色→離子交換→一次蒸發(fā)→異構(gòu)化→脫色→離子交換→成品蒸發(fā)→果葡糖漿[5]，不同生產(chǎn)企業(yè)可能會(huì)有細(xì)微的差別，但關(guān)鍵步驟不能缺少。筆者采用rDNA序列分析和形態(tài)學(xué)分析，對(duì)某企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中工藝路線不同環(huán)節(jié)的果葡糖漿樣品進(jìn)行微生物鑒定，取樣點(diǎn)主要是水來(lái)源、糖化、脫色、離子交換、蒸發(fā)和異構(gòu)等環(huán)節(jié)，并分析其可能的來(lái)源。

2材料與方法

2.1樣品

某企業(yè)生產(chǎn)的某批次果葡糖漿不同環(huán)節(jié)樣品。

2.2培養(yǎng)基

改良培養(yǎng)基：NaCl 5 g，Trptone10 g，Yeast Extract 5 g，3 g牛肉膏，加水定容至1 L，pH 6.0 , 121 ℃滅菌25 min。

2.3材料

PCR主要試劑：PCR Buffer、dNTP、Taq 酶及Goldview 熒光染料由TaKaRa 公司提供；TAE緩沖液、瓊脂糖、Tris、Trptone、Yeast Extract為進(jìn)口分裝的分析純，NaCl為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.4儀器

PCR儀(T-GRADIENT)，德國(guó)Biometra 公司；振蕩培養(yǎng)箱(ZQLY300F)，上海知楚儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱(SPX-3008SH-Ⅱ)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；電泳槽(DYCZ)、電泳儀(DYY-6C)，北京六一儀器廠；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-IBM)，蘇州安泰空氣有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(5417R)，德國(guó) Eppendorf 公司；分析天平(BS224S)、pH計(jì)(EC20)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；三重純水蒸餾器(SZ-97)，北京瑞邦興業(yè)科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(GBoX-HR-E-M)，英國(guó)Syngene 公司。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1菌種的分離純化

采用涂布分離法。在無(wú)菌條件下，將果葡糖漿生產(chǎn)工藝中不同操作單元的十個(gè)樣品分別取10 mL經(jīng)過(guò)0.22 mm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，將濾膜上的微生物用200 μL無(wú)菌水沖洗，稀釋并涂布于改良培養(yǎng)基上，并將培養(yǎng)皿在37 ℃下培養(yǎng)2—3 d。挑取單菌落進(jìn)行相關(guān)形態(tài)學(xué)分析和分子生物學(xué)鑒定。

3.2細(xì)菌分離株的16S rDNA 序列分析[6]

16S rDNA細(xì)菌通用引物：27F-AGAGTTTGATCATGGCTCAG，1492R-TACGGCTACCTTGTTACGAC-TT[7]。

通過(guò)煮沸法提取細(xì)菌DNA模板：挑取活化的單菌落，接入液體改良培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，取200 μL菌液于EP管中，離心后去上清用無(wú)菌水洗菌體2次，再加入50 μL無(wú)菌水重新懸浮，沸水煮10 min，冰浴5 min，12 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，制成菌裂解液作為PCR模板，4 ℃條件下保存[8]。

PCR反應(yīng)體系為50 μL：Taq酶0.25 μL；10×PCR Buffer 5 μL；2.5 mmol /L 的dNTP 4 μL；上游引物及下游引物各1 μL(10 mmol /L)；菌裂解液模板5 μL；無(wú)菌去離子水33.75 μL。

PCR條件為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)30 次，72 ℃ 8 min。

3.3酵母菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析

26S rDNA D1/D2區(qū)域序列擴(kuò)增引物為：NL1 5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′；NL4 5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′[9]。

對(duì)于用細(xì)菌通用引物沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)的模板樣品再用擴(kuò)增真菌26S rDNA D1/D2區(qū)域引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先通過(guò)煮沸法提取真菌DNA模板：挑取活化的單菌落，接入液體改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，取200 μL菌液于離心管中，離心后棄上清，用無(wú)菌水洗沉淀的菌體2次，再加入50 μL無(wú)菌水重新懸浮細(xì)胞，沸水煮10 min，-80 ℃低溫冷凍15 min，冰浴5 min，再用沸水煮10 min，冰浴5 min，12 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入小EP管中，作為PCR擴(kuò)增的模板，4 ℃保存。

PCR反應(yīng)體系與3.2的PCR反應(yīng)體系相同。

PCR條件為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)30次，72 ℃8 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1樣品污染菌的形態(tài)分析

對(duì)10個(gè)已經(jīng)編號(hào)的樣品涂布后，肉眼分別觀察其在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況。其中有三個(gè)平板分別生長(zhǎng)出來(lái)大小形狀不同的菌落。其微生物指標(biāo)見(jiàn)表1。

4.2分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)提取的模板全部用細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。對(duì)于用細(xì)菌通用引物沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)的模板改用真菌引物NL1、NL4擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。

1：S1 膜過(guò)濾水；2：A16一套離子交換；3：S2 二套離子交換；4：S4 異構(gòu)；5：S5 三套蒸發(fā)；6：A11 一套脫色；7：A12 一套脫色；M：DL 2000 DNA Marker；8：S9 糖化；9：S15 二套蒸發(fā)；10：A3異構(gòu)；11：A17 糖化；12：A7混床；13：A14 二套脫色圖1　16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

1：A7混床；2：A16一套離子交換；3：A11 一套脫色；4：A12 一套脫色；5：A3異構(gòu)；M：DL 2000 DNA Marker；6：A17 糖化；7：A13 二套脫色圖2　引物NL1，NL4擴(kuò)增26S rDNA結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序后，其測(cè)序結(jié)果序列參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行BLASTN比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

5結(jié)果與討論

從測(cè)序結(jié)果來(lái)看，該產(chǎn)品的主要污染菌為酵母和桿菌。結(jié)合該工廠生產(chǎn)的工藝流程，首先在水處理環(huán)節(jié)，企業(yè)在生產(chǎn)中由于不能及時(shí)更換水處理的濾芯，導(dǎo)致了所用水的污染。在糖化和一套脫色環(huán)節(jié)取樣檢測(cè)到的A17和A11，序列比對(duì)分析均為馬克斯克魯維酵母，且它們26S rDNAD1/D2區(qū)一致性為100%，在異構(gòu)和二套脫色環(huán)節(jié)中檢測(cè)到的A3和A13，序列比對(duì)分析結(jié)果均為耐熱克魯維酵母，它們的26S rDNAD1/D2區(qū)一致性也為100%。所以推測(cè)工藝上游微生物的污染延續(xù)到下游，具有很大的關(guān)聯(lián)性，因此控制上游的糖化和異構(gòu)環(huán)節(jié)的微生物污染是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。

表1不同樣品對(duì)應(yīng)的理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)及測(cè)序比對(duì)分析結(jié)果

樣品名稱測(cè)序編號(hào)(CFU·g-1)菌落種類(lèi)16SrDNA或26SrDNA序列比對(duì)結(jié)果膜過(guò)濾水S1≥1041種Unculturedbacteriumclone與未培養(yǎng)的微生物相似度很高(99%)混床A720—301種Kodamaeaohmeristrain奧默柯達(dá)菌糖化S9≥100A17≥1002種Acinetobactersp.不動(dòng)桿菌Kluyveromycesmarxianus馬克斯克魯維酵母一套脫色A11≥100A12≥1002種Kluyveromycesmarxianus馬克斯克魯維酵母Ogataeapolymorpha多形漢遜酵母一套離子交換A168—101種Torulasporasp.球有孢圓酵母異構(gòu)A3≥104S4≥1042種Kluyveromycesthermotoleran耐熱克魯維酵母Bacillussp.巨大芽孢桿菌二套脫色A13≥3201種Lachanceafermentati 耐熱克魯維酵母二套離子交換S210—121種Bacillussp.芽孢桿菌二套蒸發(fā)S151-51種Bacillussp.芽孢桿菌三套蒸發(fā)S5≥301種Pantoeasp.泛菌屬細(xì)菌

在軟飲料生產(chǎn)領(lǐng)域中，最常見(jiàn)的是酵母污染，由于它耐受二氧化碳，喜歡在有糖或者偏酸的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，而且生產(chǎn)過(guò)程中的各種容器及管道等設(shè)備內(nèi)的糖液殘留物正好給酵母菌提供了生長(zhǎng)繁殖的條件。本批次產(chǎn)品取樣時(shí)間在夏天，夏天溫度較高，微生物極易繁殖。另外，環(huán)境濕度大，換氣不足，經(jīng)常有糖液灑在地上，致使酵母大量生長(zhǎng)繁殖，漂浮于空氣之中，造成空氣被污染[11-14]。因而在飲料生產(chǎn)的全過(guò)程中，它無(wú)孔不入，成為飲料生產(chǎn)的大敵。在工藝環(huán)節(jié)中，只要稍有不慎，酵母會(huì)很快入侵并迅速繁殖，導(dǎo)致大量產(chǎn)品變質(zhì)，給企業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此企業(yè)對(duì)各車(chē)間內(nèi)及工藝管道的定期清理及消毒是非常必要的，這在很大程度上會(huì)遏制微生物的生長(zhǎng)進(jìn)而保護(hù)產(chǎn)品不被污染。

另一方面，由于芽孢桿菌的芽孢抗逆性極強(qiáng)，可在高溫條件下生長(zhǎng)繁殖。不動(dòng)桿菌屬于革蘭氏陰性菌，廣泛分布于外界環(huán)境中，而且非常容易在潮濕的環(huán)境中生存。該菌多數(shù)菌株有莢膜，黏附力極強(qiáng)，易在管道內(nèi)壁上黏附而成為貯菌源[15-16]。而本批次產(chǎn)品恰好在糖化和異構(gòu)環(huán)節(jié)中檢測(cè)到了大量的桿菌，因此推測(cè)污染該產(chǎn)品的細(xì)菌關(guān)鍵點(diǎn)在于異構(gòu)和糖化的控制點(diǎn)中。異構(gòu)是整個(gè)果葡糖漿生產(chǎn)工藝中最關(guān)鍵之處，有很多因素影響異構(gòu)過(guò)程，葡萄糖液經(jīng)過(guò)裝有固定化異構(gòu)酶的反應(yīng)器即可被異構(gòu)化，異構(gòu)酶在灌柱之前，必須先徹底清洗異構(gòu)柱并用蒸汽滅菌，等到其溫度冷卻至60 ℃以后才能灌入異構(gòu)酶。而在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，異構(gòu)化反應(yīng)柱應(yīng)停止使用，更換新酶，一般來(lái)說(shuō)，異構(gòu)酶制劑的運(yùn)行周期最長(zhǎng)為120—200 d，因此要及時(shí)對(duì)無(wú)利用價(jià)值的固定化異構(gòu)酶要及時(shí)從異構(gòu)柱中排出，且清洗異構(gòu)柱以防止細(xì)菌的滋生。另外，在糖化過(guò)程中加入糖化酶，在緩慢攪拌下60 ℃保溫一定的時(shí)間達(dá)到糖化終點(diǎn)后，必須立即升溫到80 ℃以上進(jìn)行滅酶處理[17-18]，如果不進(jìn)行滅酶處理或者滅酶不徹底，那么酶制劑中帶入的微生物就非?？赡苓M(jìn)入下一個(gè)工藝環(huán)節(jié)。綜上，對(duì)異構(gòu)柱和工藝管道及時(shí)進(jìn)行清理，排出剩余的廢棄酶制劑并及時(shí)進(jìn)行高溫徹底滅菌是解決細(xì)菌及真菌酵母污染的關(guān)鍵手段。

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Analysis and identification of spoilage bacteria from the production process of fructose syrups

LICun-zhi，MAOLing-qi，YANDa-zhong

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023,China)

Abstract：Fructose syrups produced in a factory were contaminated with microorganism partly. Samples at different operational units in fructose syrup production were collected and the main microorganisms were identified by analyses of 16S rDNA or 26S rDNA sequences, and identified as Bacillus sp. and Kluyveromyces sp. Through the identification of spoiled strains, combined with actual production process, the sources of pollution were found. This study can provide the reasonable and effective scientific basis for controlling the potential microorganisms in production process.

Key words：fructose syrups; pollutant source analysis; strain identification; Bacillus sp; Kluyveromyces sp

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 93.331

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.01.007

文章編號(hào)：2095-7386(2016)01-0030-04

作者簡(jiǎn)介：李存治(1990-)，男，碩士研究生，E-mail:cunzhili@163.com.通信作者：閆達(dá)中(1968-)，男，副教授，博士，E-mail: yandz6808@163.com.

收稿日期：2015-10-12.