珠子參多糖結(jié)構(gòu)的初步表征和抗補體活性研究

楊　濤，陳　平

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

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珠子參多糖結(jié)構(gòu)的初步表征和抗補體活性研究

楊濤，陳平

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

摘要：采用水提醇沉法提取珠子參根莖中的粗多糖，經(jīng)活性炭脫除色素、Sevage法脫除蛋白質(zhì)后得到珠子參精制多糖。苯酚硫酸法測定珠子參多糖的含量、高效液相色譜法(HPLC-GPC)測定其相對分子量、紅外光譜法對珠子參多糖的結(jié)構(gòu)進行分析并采用細胞溶血法對經(jīng)典途徑抗補體活性進行研究。結(jié)果：精制后的珠子參多糖含量約為92.4%，相對分子質(zhì)量為1.25×10(4 )Da;紅外光譜結(jié)果表明:珠子參多糖具有明顯的多糖特征峰；抗補體實驗表明珠子參多糖具有良好的抗補體活性。

關(guān)鍵詞：珠子參多糖；結(jié)構(gòu)表征；抗補體活性

1引言

珠子參是五加科(Araliaceae)人參屬(Panax.L)植物珠子參PanaxjaponicusC. A. Mey.var.major(Burk.) C. Y. Wu et K. M. Feng的干燥根莖[1]，歷來就是被中國藥典收載的一種名貴中藥材。珠子參性味苦、甘、微寒，主治關(guān)節(jié)疼痛、虛勞咳嗽、氣陰兩虛、跌撲損傷等病癥[2]。人參屬植物的化學(xué)成分研究已經(jīng)有一百多年的歷史，皂苷類化合物一直以來就被公認是主要的活性物質(zhì)，但是皂苷不能代表人參屬植物的所有成分也不能全部闡明人參屬植物的藥理活性和臨床療效。隨著現(xiàn)代生化藥學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，為了解釋人參屬植物的藥理機制，越來越多的學(xué)者將研究重心轉(zhuǎn)移到了多糖上，最近的信息顯示多糖的醫(yī)療價值逐漸被人們發(fā)掘，竹節(jié)參、人參、西洋參等一大批中藥的基礎(chǔ)性研究取得進展，其中三七多糖、竹節(jié)參多糖、人參多糖[3-5]等都被證實具有很強的藥理活性。珠子參同樣為五加科人參屬藥用植物，根據(jù)同科屬的藥用植物具有較為一致的化學(xué)成分的規(guī)律，我們認為珠子參中的多糖成分同樣具有較為重要的藥用價值。但是目前國內(nèi)對珠子參植物的研究主要集中在珠子參的栽培生產(chǎn)技術(shù)[6-7]和有效成分的提取工藝上[8-9]，因此對珠子參多糖的系統(tǒng)性研究迫在眉睫。本實驗擬為珠子參多糖的提取奠定基礎(chǔ)；通過適當(dāng)手段精制多糖和鑒定其結(jié)構(gòu)并初步探討珠子參多糖的抗補體活性。

2材料與方法

2.1儀器設(shè)備及材料

PB203-N型與XP205型電子天平(瑞士METTLER TOLED GROUP)；Evolution 300紫外/可見光分光光度計(德國THERMO)；LC-250超聲波清洗機(濟寧市中區(qū)魯超儀器廠)；YB-Z真空恒溫干燥箱(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)；Milli-Q Reference超純水機(德國默克)；Centrifuge 5804R冷凍高速離心機(德國EPPENDORF)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters 公司)；xMark型酶標(biāo)儀(美國Bio-RAD)；2%綿羊紅細胞、豚鼠血清均來自于武漢生物制品檢定所。珠子參,購自云南。

2.2方法

2.2.1珠子參多糖的提取

本實驗采用水提醇沉法[10]對珠子參藥材中的多糖成分進行提取。具體實驗操作步驟如下：用高速萬能粉碎機將珠子參藥材打磨成細粉然后用75%的乙醇，在85 °C下回流提取2次，每次2 h。快速離心去掉上層的有色物質(zhì)、寡糖和一些小分子物質(zhì)，將下層濾渣置于40 °C真空干燥箱中干燥盡量去掉其水分。將干燥好的藥渣加入40倍量水(料液比1∶40)，在90 °C下回流提取2次，每次3 h。高速離心機離心去掉不溶性濾渣后合并每一步的濾液，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至15 mL左右加入無水乙醇，使其最終濃度達到80%，會發(fā)現(xiàn)有白色絮狀沉淀生成。在4 °C冰箱中靜置過夜，8 000 r/min下離心收集沉淀，冷凍干燥后即得珠子參粗多糖[11]。

2.2.2珠子參多糖的精制

將冷凍干燥得到的珠子參粗多糖溶于適量溫水，將多糖溶液體積0.5%的活性炭加入溶液中一起加熱回流15 min脫色，重復(fù)以上步驟一到兩次離心棄渣。在脫色后的珠子參多糖溶液中加入適量的氯仿—正丁醇(4∶1)溶液，反復(fù)震蕩15 min脫蛋白[12]，重復(fù)以上步驟多次直到不產(chǎn)生沉淀為止。

2.2.3珠子參多糖含量的測定

珠子參多糖總糖含量的測定采用崔紅華等[13]在測定人參多糖含量中建立的苯酚硫酸法。具體實驗操作步驟如下：用容量瓶準(zhǔn)確配制1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。1mL的刻度吸管分別量取0 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液到5 mL具塞試管中，加純化水補至1.0 mL，使各管濃度依次為0 mg/mL， 0.02 mg/mL，0.04 mg/mL，0.06 mg/mL， 0.08 mg/mL，0.1 mg/mL。依次在每管中加入新配制好的0.5 mL 6% 的苯酚溶液和2.5 mL的濃硫酸，在振蕩器上快速振蕩搖勻，沸水浴15 min，在冰水中迅速冷卻到室溫，用空白管調(diào)零，用分光光度計在490 nm處分別測定其余各管的OD值。以葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL)，OD值為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。珠子參多糖含量的測定：將珠子參多糖準(zhǔn)確稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度的范圍內(nèi)，按以上的步驟操作，測量其OD值，將測好的OD值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算即可得到珠子參多糖的含量。

2.2.4珠子參多糖相對分子量的測定

采用凝膠滲透色譜法和示差折光檢測器對提取的珠子參多糖的相對分子量進行測定。色譜柱為凝膠色譜柱TSKgel G4000SWxl，流動相為0.7%的Na2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫30 °C，示差折光檢測器溫度為35 °C。配制相對分子量不同的五種右旋葡聚糖酐標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液相繼進樣[14]。然后以標(biāo)準(zhǔn)分子量葡聚糖酐的保留時間為橫軸，分子量的對數(shù)為縱軸，建立分子量對數(shù)和保留時間關(guān)系的線性曲線。在相同的色譜條件下，將濃度約為10 mg/mL珠子參多糖樣品自動進樣，記錄其保留時間，用龍智達色譜工作站進行數(shù)據(jù)處理分析，即可計算出珠子參多糖樣品的相對分子量。

2.2.5珠子參多糖的紅外光譜分析

取大約2 mg干燥至恒重的珠子參多糖樣品與200 mg的溴化鉀粉末混勻后進行壓片，用傅立葉紅外光譜在4 000—400 cm-1波長范圍內(nèi)掃描，記錄珠子參多糖的紅外光譜圖。

2.2.6珠子參多糖抗補體活性分析

采用細胞溶血法對珠子參多糖經(jīng)典途徑的抗補體活性[15]進行測定。通過本實驗室前期的補體濃度測試，新鮮的豚鼠血清稀釋80倍作為最低溶血濃度，與珠子參多糖樣品充分混勻后加下列配置好的試劑，實驗同時設(shè)置多糖對照組、補體組和全溶血組，見表1。 將上述混合完全的樣品在37 °C下水浴60 min， 0 °C冰箱內(nèi)冷卻5 min，2 000r/min離心5 min ，取每管上清液在405 nm波長下用分光光度計測定OD值。珠子參多糖溶血活性的抑制率計算方法如下列公式：抑制率(%)= [(標(biāo)準(zhǔn)對照OD值-樣品對照OD值)/標(biāo)準(zhǔn)對照OD值] × 100%，最后以珠子參多糖濃度作X軸，珠子參多糖的溶血抑制率為Y軸作圖，計算珠子參多糖抗補體活性的CH50值。

表1補體經(jīng)典途徑溶血實驗所加各成分體積/mL

組別BBS緩沖液純化水補體珠子參多糖溶血素2%綿陽紅細胞實驗組0.2—0.10.10.10.1對照組0.5——0.1——補體組0.3—0.1—0.10.1全溶組—0.5———0.1

3結(jié)果及討論

3.1珠子參多糖含量的測定

珠子參多糖含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

該葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=11.97X-0.0526,R2=0.9986，說明在0.02—0.1 mg/mL濃度范圍內(nèi)，葡萄糖的含量與吸收度值呈良好線性關(guān)系。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計算精制后的珠子參多糖含量為98.6%。

3.2珠子參多糖相對分子量的測定

采用GPC專用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Log(Mw)=9.2379-0.2926tR，R2=0.9996。Mw為標(biāo)樣的已知重均分子量；tR為標(biāo)樣的保留時間。得到的珠子參多糖的HPGPC圖譜見圖2。通過GPC軟件計算可得珠子參多糖的相對分子量為1.25×104Da。

3.3珠子參多糖紅外分析

圖3為珠子參多糖在紅外區(qū)掃描獲得的紅外光譜圖。

圖3　珠子參多糖紅外光譜圖

從紅外光譜圖上可以看出，3 369 cm-1處強而寬的吸收峰為羥基(-OH)的振動吸收峰，2 938 cm-1處的吸收峰為亞甲基(C-H)的伸縮振動吸收峰，1 641 cm-1處吸收峰說明了C=O峰的存在。

3.4多糖抗補體活性研究

在抗補體實驗中通常選取肝素鈉作為陽性對照組[16]，一種具有很強抗補體活性的物質(zhì)。CH50值即在抗補體實驗中能夠使補體系統(tǒng)產(chǎn)生50%溶血的最低樣品濃度。珠子參多糖的抗補體活性CH50為0.31 mg/mL，陽性對照肝素的抗補體活性CH50為0.24 mg/mL，表明珠子參多糖在經(jīng)典途徑中有較好的抗補體活性。

4結(jié)束語

利用水提醇沉法提取珠子參藥材中的多糖有效成分，對其結(jié)構(gòu)進行基本的表征并研究其藥理活性。提取出的粗多糖含有多種雜質(zhì)，先利用活性炭吸附法除去粗多糖中的色素，然后采用Sevage法脫除蛋白，至此得到純度比較高的珠子參多糖組分。采用高效液相色譜法測得珠子參多糖的相對分子量為1.25 × 104Da，紅外光譜表明其具有明顯的多糖特征峰。經(jīng)典途徑抗補體活性實驗證明，珠子參多糖具有很好的抗補體活性，這為珠子參多糖開發(fā)成抗補體藥物提供了初步的科學(xué)依據(jù)，也為珠子參的擴大應(yīng)用提供了新的途徑。

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Preliminary characterization and anti-complementary activity of polysaccharides from Rhizoma Panacis Majoris

YANGTao,CHENPing

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering ,Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023，China)

Abstract：Preliminary characterization and anti-complementary activity of polysaccharides from Rhizoma Panacis Majoris were studied. Crude polysaccharides from Rhizoma Panacis Majoris was obtained by water extraction and ethanol precipitation. Then the crude polysaccharides was depurated by the following method: Decolorized by active carbon; removed protein by Sevage way. The total carbohydrate content was determined by the Phenol-Sulfuric acid method, with D-glucose as the standard; the molecular weight (MW) was determined by HPLC-GPC; chemical structure was investigated by FT-IR. The anti-complementary activity was evaluated with the hemolysis assay. The results showed that the total carbohydrate content was 92.4%, the molecular weight (MW) was 1.25 × 104 Da, FT-IR spectra confirmed obvious characteristic peaks of polysaccharides. The hemolysis assay was exhibited that polysaccharides from Rhizoma Panacis Majoris showed anti-complementary activity.

Key words：Rhizoma Panacis Majoris; structure characterization; anti-complementary activity

中圖分類號：Q 539

文獻標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.01.006

文章編號：2095-7386(2016)01-0026-04

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81274023).

作者簡介：楊濤(1990-)，男 碩士研究生，E-mail：shuangfentao@iCloud.com.通信作者：陳平(1958-)，女 教授，E-mail：chenpingvip24@163.com.

收稿日期：2015-12-08.