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    向日葵菌核病生防菌的篩選與鑒定

    2016-04-25 02:17:11何思宇李婷婷郭晶晶李曉全
    關(guān)鍵詞:沙雷氏盤菌菌核病

    何思宇,李婷婷,郭晶晶,李曉全,韓 冰

    (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

    菌核病是向日葵的一種常見(jiàn)病,又稱爛盤病、白腐病,病原為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)。自發(fā)現(xiàn)該病以來(lái),它的發(fā)病面積一直在不斷擴(kuò)大,發(fā)病率也在不斷地上升,這種病害在向日葵主產(chǎn)區(qū)里每年發(fā)病率在50%左右,有時(shí)可高達(dá)70%以上[1]。對(duì)向日葵的品質(zhì)和產(chǎn)量影響很大,也給農(nóng)民帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。菌核病是由核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)真菌侵染引起的病害。在條件適宜的情況下,菌核開(kāi)始萌發(fā),可直接形成菌絲侵染寄主,也可形成子囊盤產(chǎn)生子囊和子囊孢子,子囊孢子隨風(fēng)雨傳播到寄主表面后,發(fā)芽成菌絲,侵染致使向日葵發(fā)病。該病導(dǎo)致向日葵的莖折、根莖部腐爛、花盤、葉及種仁腐爛等。花盤受害時(shí),從底面到表面布滿白色絨毛狀菌絲層,內(nèi)有黑色菌核。莖部發(fā)病時(shí),病部表面有白色絨毛狀的薄膜,褪色后,形成灰白色圓形或橢圓形斑點(diǎn)[2]。

    目前,應(yīng)用的防治方法主要是藥劑防治,用40%紋枯利800~1000倍液或50%托布津可濕性粉劑1000倍液在向日葵現(xiàn)蕾前或在盛花期噴灑1~2次。用50%速克靈500~1000倍液在苗期或開(kāi)花期噴灑[3]。目前,雖然藥劑防治和抗病育種的方面取得了一些成果,但藥物防治成本高且會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染,而抗病育種的收效不大。

    生物防治具有安全、環(huán)保、成本低等特點(diǎn)。許多學(xué)者在生物防治方面都做了嘗試。張一名從向日葵根圍土壤中分離得到1株枯草芽孢桿菌,通過(guò)拮抗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)核盤菌菌絲生長(zhǎng)點(diǎn)附近出現(xiàn)明顯的異常分枝和囊泡狀畸形,在距該菌株一定范圍內(nèi)核盤菌不能形成菌核[4]。王鵬研究表明,一種非致病菌尖孢鐮刀菌產(chǎn)生的環(huán)孢素a能夠抑制核盤菌菌絲的生長(zhǎng)和菌核的形成,因此環(huán)孢素a可作為生防劑;同時(shí)發(fā)現(xiàn)假單胞菌的2個(gè)不同菌株能很好地抑制核盤菌子囊孢子初期萌發(fā)[5]。還有其他研究表明,鏈霉菌、地衣芽孢桿菌、辣椒溶桿菌、油菜假單胞菌均屬于向日葵菌核病生防菌[6]。本研究通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)、盆栽試驗(yàn)方法對(duì)從內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市采摘的向日葵花盤和根進(jìn)行生防菌的系統(tǒng)分離篩選,以期找到對(duì)向日葵菌核病菌有顯著抑制作用并能適應(yīng)內(nèi)蒙古生態(tài)條件的優(yōu)良生防菌株。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    生防細(xì)菌分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗采集的5株未感染病的向日葵根及花盤。向日葵菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理室提供。

    1.2 試驗(yàn)方法

    菌株的分離、純化:將供試向日葵的根和花盤表面消毒后,加無(wú)菌水和石英砂充分研磨,稀釋成10-1、10-2、10-3共3個(gè)梯度,吸取每個(gè)梯度研磨液20 μL分別涂布3個(gè)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)和3個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)。置于24°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1~7 d,依據(jù)菌落形態(tài)、顏色、透明度、光滑度等特征,挑取單菌株,純化保存。

    1.3 生防菌的篩選

    1.3.1 拮抗菌的初篩 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。在PDA平板上中心處接種直徑6 mm病原菌菌餅,在距離中心3 cm互相垂直的4個(gè)點(diǎn)接種不同的待測(cè)菌株,每一組合重復(fù)3次,以中央只接種病原真菌的平板為對(duì)照,放于培養(yǎng)箱中24°C培養(yǎng)。

    1.3.2 拮抗菌的復(fù)篩 將病原菌菌餅反貼于PDA培養(yǎng)基中央,于24°C下培養(yǎng),待病原菌菌落直徑長(zhǎng)到2 cm時(shí),用接種環(huán)挑取待測(cè)菌株,從病原真菌的一側(cè)沿與其生長(zhǎng)方向相交的方向劃線接種[7];對(duì)照實(shí)驗(yàn):以S.sclerotiorum為指示菌,以枯草芽孢桿菌為測(cè)試菌,作陽(yáng)性對(duì)照組;以不接菌株和以無(wú)菌水代替測(cè)試菌為空白對(duì)照組;以培養(yǎng)基代替測(cè)試菌為環(huán)境對(duì)照組。

    1.3.3 抑菌帶的測(cè)量 以S.sclerotiorum為指示菌,將病原菌菌種預(yù)先培養(yǎng)在PDA平板上待菌落長(zhǎng)至5 cm直徑,用打孔器打取6 mm直徑菌塊,接種在培養(yǎng)皿中央,在周圍等距離用穿刺法接種待測(cè)菌株,24°C下72 h后觀察抑菌帶寬度。并觀察抑菌帶附近菌絲形態(tài)。

    1.4 菌株N9、N22的形態(tài)特征和細(xì)菌生理生化特征的測(cè)定

    參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]中假單胞菌屬和沙雷氏菌屬的鑒定方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、膿青素的產(chǎn)生、明膠液化、耐鹽度等特性的鑒定。

    1.5 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

    1.5.1 菌種DNA提取 CTAB法提取DNA[9]。用1%濃度瓊脂糖水平凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

    1.5.2 PCR擴(kuò)增16S rDNA序列 以細(xì)菌總DNA為模板,27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')為引物擴(kuò)增N9和N22的16S rDNA序列,目的片段長(zhǎng)度為1400 bp 左右。 PCR 體系為:10×PCR Buffer 5.0 μL,2.5 mM dNTPs 4.0 μL,F(xiàn)orward Primer(10 μM)1.0 μL,Reverse Primer (10 μM)1.0 μL,模板 DNA 3.0 μL,Taq DNA 聚合酶 0.5 μL,加ddH2O至終體積50.0 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min;94℃變性35 s;55℃退火 45 s;72℃ 延伸 1.5 min;30個(gè)循環(huán)后;72℃延伸8 min。

    1.5.3 16S rDNA序列測(cè)定及分析 將PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析,采用MEGA 6.0程序的Neighborjoining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

    1.6 盆栽向日葵的生防實(shí)驗(yàn)

    1.6.1 向日葵種子的處理 在超凈臺(tái)中,用75%的酒精和1%的次氯酸鈉對(duì)向日葵種子表面消毒后用發(fā)酵48 h生防菌原液浸泡種子30 min。

    1.6.2 土壤處理 將購(gòu)買的營(yíng)養(yǎng)土與蛭石1∶1混合,土壤高溫滅菌后裝入15 cm×15 cm的花盆內(nèi),將處理過(guò)的向日葵種子播種,出苗后每盆留苗1株。每盆接入菌核5 g[10],撒于盆栽表土上,上覆2 cm厚的薄土,用前面所篩效果最好的兩種生防菌N9和N22發(fā)酵原液處理土壤,發(fā)酵原液按用量分別為25 mL、50 mL、100 mL 3個(gè)梯度處理[10],B為只接病原菌處理、C為空白對(duì)照各3個(gè)處理(表1)。對(duì)照植株發(fā)病后測(cè)定發(fā)病率和防治效果。

    發(fā)病率/%=[病株數(shù)/總處理株數(shù)]×100

    防治效果/%=[(對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對(duì)照發(fā)病率]×100[11]

    表1 實(shí)驗(yàn)處理

    1.6.3 生物量及株高的測(cè)定[12]實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)量向日葵的株高,再置于65°C條件下烘干至恒重。分別記錄地上生物量、地下生物量、總生物量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 拮抗細(xì)菌的篩選

    從向日葵植株的根及花盤中分離得到187個(gè)分離物,經(jīng)過(guò)平板對(duì)峙法的初篩和復(fù)篩獲得4株具有拮抗作用的細(xì)菌,分別為 N3、N9、N18、N22。從平板對(duì)峙法的結(jié)果看,N9和N22在不同時(shí)期都對(duì)核盤菌有較好的抑制效果??莶菅挎邨U菌(陽(yáng)性對(duì)照)抑菌帶寬度為0.5 mm、N22抑菌帶寬度為3.0 mm、N9抑菌帶寬度為2.8 mm。

    設(shè)枯草芽孢桿菌為陽(yáng)性對(duì)照,由圖1看出N22、N9的拮抗效果比枯草芽孢桿菌的拮抗效果強(qiáng)。與空白對(duì)照組比較,菌株N22、N9抑菌帶附近的核盤菌在一定范圍內(nèi)不能形成菌核;空白組菌絲生長(zhǎng)旺盛,有菌核生成。由于培養(yǎng)核盤菌的培養(yǎng)基與培養(yǎng)N22、N9的培養(yǎng)基不同,為排除培養(yǎng)基成分對(duì)核盤菌生長(zhǎng)的影響,特設(shè)環(huán)境對(duì)照組表明培養(yǎng)基成分對(duì)核盤菌生長(zhǎng)無(wú)影響。

    2.2 N9、N22的形態(tài)學(xué)鑒定

    透射電鏡下,放大20000倍后觀察到,N9為桿狀菌且有極生鞭毛,菌體大小為(0.3~0.4)μm×(0.9~1.2)μm,革蘭氏染色為陰性。在NA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h后,菌落可產(chǎn)生橙色色素,圓形,不透明,表面凸起,光滑,較黏稠,易挑起,邊緣整齊。N22為短桿狀菌且有周生鞭毛,菌體大小為(0.5~0.7)μm×(1.5.~1.8)μm,革蘭氏染色為陰性。在NA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h后,菌落表面光滑不透明,可產(chǎn)生紅色色素,圓形,較黏稠,易挑起,邊緣整齊。

    2.3 生理生化特征分析

    N22、N9及標(biāo)準(zhǔn)菌株黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的生理生化特征進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。生理生化實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株:黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)從中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)購(gòu)買。

    由表2可知,N9能水解精氨酸雙水解酶、脂酶、氧化酶、過(guò)氧化氫酶、檸檬酸鹽、明膠,不水解淀粉,也不產(chǎn)生H2S,能利用卵磷脂酶,不產(chǎn)生膿青素,也不進(jìn)行反硝化作用。最適生長(zhǎng)的NaCl濃度為2%~5%,當(dāng)NaCl濃度為5%時(shí)菌落顏色為白色,NaCl濃度為7%時(shí)不生長(zhǎng)。

    表2 細(xì)菌生理生化特征分析

    N22能水解脂酶、過(guò)氧化氫酶、明膠、七葉靈、不水解精氨酸雙水解酶、氧化酶、脲酶、苯丙氨酸脫氨酶、也不產(chǎn)生H2S,能利用檸檬酸鹽、丙二酸。最適生長(zhǎng)的NaCl濃度為2%~7%,NaCl濃度為7%時(shí)只有少量單菌落,菌落顏色為白色,NaCl濃度為10%時(shí)不生長(zhǎng)。

    2.4 16S rDNA序列分析

    將N9和N22的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析后。結(jié)果表明,N9與假單胞菌屬有較高的同源性,與綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis,DQ682655)有99%的相似性。N22與沙雷氏菌屬的細(xì)菌有較高同源性,與深紅沙雷氏菌(Serratia rubidaea,AB004571)相似性達(dá)100%。

    將N9和N22的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析后,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖 3,N9與Pseudomonas chlororaphis形成最小分支,N22與Serratia rubidaea形成最小分支。依據(jù)N9和N22的生理生化特征及建樹(shù)結(jié)果,將N9鑒定為綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis),N22鑒定為深紅沙雷氏菌(Serratia rubidaea)。

    2.5 盆栽向日葵的生防實(shí)驗(yàn)

    將篩選到的N9和N22作為供試菌,試驗(yàn)所用向日葵供試種子為GE817,進(jìn)行盆栽向日葵菌核病的防治效果比較。結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果表明,N9和N22兩株供試拮抗菌發(fā)酵原液處理土壤的不同用量對(duì)向日葵菌核病均表現(xiàn)出一定的控制效果。其中N22拮抗菌株25 mL發(fā)酵原液處理土壤后對(duì)向日葵菌核病的防效均達(dá)到最高,其防治效果為100%。從防治效果看(表3),2個(gè)菌株處理土壤的發(fā)酵原液用量對(duì)向日葵菌核病的防效存在顯著差異,同比之下N22的防治效果更好一些。N9與N221∶1混合發(fā)酵原液處理的向日葵有明顯的促生長(zhǎng)作用(表4);其中50 mL發(fā)酵液處理的向日葵株高效果最佳,其中100 mL發(fā)酵液處理的向日葵生物量最高。

    表3 拮抗菌株N9和N22對(duì)向日葵菌核病盆栽防治效果

    表4 拮抗菌株N9和N22對(duì)向日葵植物生長(zhǎng)的影響

    3 討論與結(jié)論

    化學(xué)藥劑防治菌核病,不僅會(huì)使核盤菌產(chǎn)生抗藥性,并且對(duì)環(huán)境也造成了嚴(yán)重的污染,給食品安全問(wèn)題帶來(lái)了隱患。利用生防菌防治向日葵菌核病是生物防治的重要手段,此方法具有不產(chǎn)生抗性,不污染環(huán)境,僅抑制或殺傷防治對(duì)象,保持生態(tài)平衡,能參與生態(tài)環(huán)境調(diào)控,起到長(zhǎng)效作用等優(yōu)點(diǎn)。因此,篩選拮抗能力穩(wěn)定的生防菌對(duì)菌核病的防治具有重要的意義。生物防治是目前植物病害防治研究的熱點(diǎn)之一,但主要集中于生防菌的分離、篩選、生物學(xué)特征以及拮抗機(jī)理等方面的研究,但應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際并具有良好防治效果的相關(guān)報(bào)道較少。

    N9和N22兩種菌株對(duì)向日葵的菌核病均有一定的防治效果,但嘗試將兩種菌株混合在一起后處理被核盤菌侵染的向日葵,拮抗效果并不好,可能由于菌種之間的相互作用降低了對(duì)病原菌的拮抗作用,其抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究,但卻發(fā)現(xiàn)N9與N22發(fā)酵原液混合后處理未染病的向日葵有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的作用。根據(jù)形態(tài)觀察和生理生化指標(biāo)測(cè)定,查看《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》可知,菌株N9的生理生化結(jié)果與綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)相符;菌株N22的生理生化結(jié)果與深紅沙雷氏菌(Serratia rubidaea)基本相符,但N22的V.P實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性,而查看《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,深紅沙雷氏菌(Serratia rubidaea)的V.P實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性,懷疑N22為深紅沙雷氏菌(Serratia rubidaea)的另一亞種。

    N9鑒定為綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis),大量研究表明此菌為重要的生防菌,陳懷谷研究發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌對(duì)于小麥全蝕病具有明顯的防治效果,由于綠針假單胞菌菌株能在小麥根際定植,所以由該菌株制成的生防菌劑有較長(zhǎng)的持效期,并且其使用不會(huì)帶來(lái)環(huán)境問(wèn)題,有利于小麥的無(wú)公害生產(chǎn)[13]。王遠(yuǎn)山研究表明綠針假單胞菌對(duì)煙草黑脛病病原菌煙草疫霉有很強(qiáng)的拮抗作用,該菌株對(duì)煙草疫霉菌絲體有很強(qiáng)的抑制作用,并且可以完全抑制煙草疫霉游動(dòng)孢子對(duì)煙草幼苗的侵染[14]。何延靜從甜椒根際土壤中分離得到綠針假單胞菌,研究發(fā)現(xiàn)對(duì)辣椒疫霉具有強(qiáng)拮抗作用[15]。但對(duì)向日葵菌核病的防治國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),綠針假單胞菌對(duì)核盤菌也有很好的抑制效果。為向日葵菌核病的生物防治提供了理論基礎(chǔ)。

    N22鑒定為深紅沙雷氏菌(Serratia rubidaea)。沙雷氏菌(Serratia)屬腸桿菌科,在自然界分布很廣,能產(chǎn)生非水溶性黃、紫、紅色素的革蘭氏陰性小桿菌,一般存在于土壤、水、植物、動(dòng)物以及人類的腸道和呼吸道中。是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌。姜立春以華鎣山香菇作為研究材料,培養(yǎng)得到一株附生細(xì)菌,并鑒定為深紅沙雷氏菌[16]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于深紅沙雷氏菌在植物方面的報(bào)道很少,其對(duì)向日葵菌核病的防治國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

    本研究證實(shí)了綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)和深紅沙雷氏菌(Serratia rubidaea)對(duì)向日葵菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)有很好的抑制作用。經(jīng)盆栽防效試驗(yàn)所篩生防菌N9和N22,還需要在田間對(duì)其生防效果作進(jìn)一步測(cè)試。此外,它的生物學(xué)特性、抑菌機(jī)理、活性物質(zhì)成分也值得進(jìn)一步研究,以探明其在生物防治中的應(yīng)用潛力。

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    [16]姜立春,甘 毅,阮期平.一株產(chǎn)紫紅色色素的沙雷氏菌的分離與鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(28):12082-12084.

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