低鹽脅迫對壇紫菜(Pyropia haitanensis)離子轉運的影響

邢 磊，王文磊，徐 燕，紀德華，許 凱，陳昌生，謝潮添

(集美大學水產學院，福建 廈門 361021)

0 引言

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)生長于潮間帶地區(qū)，隨著潮汐變化，經常會遭受各種生物和非生物脅迫。在干出和復水的過程中，鹽脅迫是一種較為主要的脅迫因素。有研究[1]表明，紫菜能夠在26～33的鹽度范圍下正常生長。關于紫菜響應高鹽機制的研究較多。例如：Wang等[2]從轉錄組學研究入手，發(fā)現壇紫菜藻體葉狀體可以通過提高能量代謝，合成脯氨酸、甜菜堿、海藻糖等物質，提高胞內滲透壓以響應高鹽脅迫；陳天翔等[3]運用非損傷微測技術(non-invasive micro-test technology，NMT)從離子流速的角度出發(fā)，通過阿米洛利(Amiloride，Na+/H+逆向轉運蛋白抑制劑)和釩酸鈉(Vanadate，H+質子泵抑制劑)對壇紫菜響應鹽脅迫過程中鉀鈉平衡機制進行了研究，表明壇紫菜維持K+/Na+穩(wěn)態(tài)的能力是其耐鹽性的關鍵。

然而，目前關于紫菜等大型海藻應答低鹽脅迫的研究主要集中在細胞存活率、光合活性以及離子含量等生理生化指標測定層面。例如：嚴興洪等[4]的研究發(fā)現，當鹽度低于19.6時，條斑紫菜(Prophyrayezoensis)葉狀體的營養(yǎng)細胞存活率顯著降低；而羊棲菜(Hizikiafusifarme)[5]在低鹽浸泡的最初階段(15 min內)，Na+離子含量顯著下降，并且灰分干重比顯著下降，可見在低鹽浸泡的初期階段，無機離子流失較快；文獻[6]研究表明，壇紫菜在遭受淡水脅迫后，藻體Fv/Fm隨脅迫時間的增加而顯著下降，同時藻體內Na+和脯氨酸含量急劇下降以維持細胞內與水環(huán)境的滲透壓平衡。此外，與Na+含量的快速下降相比，藻體內的K+含量雖有降低，但仍能維持在較高水平，而且與藻體光合作用呈顯著正相關。但在低鹽脅迫下，壇紫菜如何維持離子穩(wěn)態(tài)，與高鹽脅迫又有何異同點尚不明確。因此，本實驗利用非損傷微測技術，通過外源添加阿米洛利和釩酸鈉進行K+、Na+、H+離子流速測定，從離子動態(tài)轉運角度研究低鹽脅迫對離子轉運的影響，以進一步完善對紫菜耐受低鹽機制的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

實驗材料：壇紫菜Z-61品系葉狀體，材料取自福建省壇紫菜種質資源庫[7]。

培養(yǎng)條件：溫度21 ℃，光照強度50～60 μmol·m-2·s-1，晝夜周期為12 h，每隔1 d更換新鮮的培養(yǎng)液。選取表面光滑，披針形，無破損、卷曲、爛葉的8～15 cm的葉狀體進行后續(xù)實驗。

低鹽營養(yǎng)液配置：取實驗室正常海水(對照組，鹽度30，記為S30組)加蒸餾水稀釋至鹽度5(記為S5組)[5]，充分攪拌均勻，高溫煮沸消毒后冷卻至21 ℃?zhèn)溆谩Ｕ麴s水鹽度為0。

藥理學處理：將壇紫菜葉狀體置于添加100 μmol 阿米洛利或200 μmol 釩酸鈉[3]的低鹽溶液中進行脅迫處理。

1.2 實驗方法

采用非損傷微測技術(NMT,Younger USA LLC,Amherst,MA)測定凈H+、Na+、K+流速。配置標準溶液，制作微電極，測定空白組5 min，等待機器穩(wěn)定。樣品經過藥理學處理后，測量前取葉狀體在平衡液中平衡1 min。參照文獻[8]的方法配置標準溶液和測量溶液，溶液濃度配方見表1。H+、K+、Na+離子測定方法為：處理15 min，在測試液中平衡1 min后進行測定。每株測定12 min，每個處理設6個重復。

表1 校正液、測試液配方及濃度

1.3 數據統(tǒng)計分析

采用Excel、Graphd prism 7.0以及SPSS 17.0對數據進行差異性分析和作圖。根據單因素方差分析方法(one-way ANOVA，LSD)比較不同處理間數據的差異性，P<0.05為顯著性差異。

2 實驗結果與分析

2.1 低鹽脅迫對壇紫菜藻體Na+流速和流向的影響

低鹽脅迫對壇紫菜藻體Na+流速和流向的影響如圖1所示：在正常狀態(tài)下(S30組)，Na+呈現內流趨勢(見圖1a)；S5組加入阿米洛利和釩酸鈉并不能降低Na+的外排(見圖1b、c)；S30組、S5組、S5+Amiloride組、S5+Vanadate組的Na+平均流速分別為-1129.22，-178.11，-32.77，19.12 pmol·cm-2·s-1(見圖1d)。

2.2 低鹽脅迫對壇紫菜藻體K+流速和流向的影響

低鹽脅迫對壇紫菜藻體K+流速和流向的影響如圖2所示：在正常狀態(tài)下(S30組)，K+呈現內流趨勢，表明葉狀體在正常狀態(tài)下會吸收K+(見圖2a)；在低鹽脅迫下(S5組)K+內流受到顯著抑制(見圖2a)，但外排速度顯著低于S30組，K+/Na+較高；在鹽度5下添加阿米洛利能導致K+顯著外排，添加釩酸鈉對K+流速無顯著影響(見圖2b、c)；S30組、S5組、S5+Amiloride組、S5+Vanadate組的K+平均流速分別為-269.77，-58.54，268.02，44.36 pmol·cm-2·s-1(見圖2d)。

2.3 低鹽脅迫對壇紫菜葉狀體H+流速和流向的影響

如圖3所示：在正常狀態(tài)下，H+在內流和外排之間進行波動，低鹽脅迫會導致H+內流(見圖3a)；與S5組相比，添加釩酸鈉后會導致H+顯著外排(見圖3c)，但添加阿米洛利對H+流速無顯著影響(見圖3b)；S30組、S5組、S5+Amiloride組、S5+Vanadate組的H+平均流速分別為0.02，-0.11，0.06，0.85 pmol·cm-2·s-1(見圖3d)。

3 討論

在低鹽脅迫下，葉狀體遭受嚴重的低滲脅迫，由于細胞內外存在較高的濃度差，會不可避免地導致離子損失。無機離子作為一種細胞質的重要組成部分，不僅起到維持細胞滲透勢的作用，還廣泛參與細胞各類生命活動。細胞內離子平衡的穩(wěn)態(tài)是活細胞維持生理作用的基礎，K+/Na+平衡對許多細胞溶質酶的活性、維持膜電位、調節(jié)細胞大小以及維持滲透壓至關重要[9]。文獻[3]發(fā)現：高鹽條件下，過多的Na+進入壇紫菜細胞，產生Na+毒害，并導致質膜去極化，激活質膜H+-ATPase驅動Na+/H+逆向轉運蛋白，將多余的Na+從細胞質外排到質外體，并且通過抑制去極化激活的外向整流K+通道緩解K+外泄，從而維持葉狀體K+/Na+平衡；而壇紫菜在遭受低鹽脅迫后，短期內會迅速降低Na+含量，但會維持較高的K+水平，從而導致葉狀體維持較高的K+/Na+。然而，低鹽脅迫下葉狀體如何維持K+、Na+穩(wěn)態(tài)，高鹽、低鹽下壇紫菜維持離子穩(wěn)態(tài)的機制是否相同尚不得知。因此，通過添加阿米洛利和釩酸鈉的藥理學實驗，利用NMT探究離子通道在細胞響應壇紫菜離子平衡中的作用。其中，非損傷微測技術(NMT)可以實時測量進出活體材料的離子或小分子流速，被廣泛應用于逆境、營養(yǎng)、發(fā)育、植物/微生物互作、光合/呼吸等領域，在鹽脅迫中有較高的運用[10-11]。

鹽生植物能利用Na+運輸來高效調節(jié)滲透壓。在藜麥(ChenopodiumquinoaWild.)的研究[12]中發(fā)現，藜麥會優(yōu)先將Na+作為便捷的滲透壓調節(jié)劑。本研究也發(fā)現，壇紫菜在正常狀態(tài)下吸收Na+以維持自身穩(wěn)態(tài)，但低鹽脅迫下壇紫菜葉狀體可快速外排Na+以應答外部低滲脅迫環(huán)境(見圖1)。Na+在植物細胞中的積累是胞外Na+通過離子通道流入與Na+/H+逆向轉運蛋白等通道的流出相平衡的結果。在高鹽脅迫下，過表達擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtSOS1可以有效降低植株Na+含量[13]。以上結果表明，鹽脅迫下植物Na+外排主要是Na+/H+逆向轉運蛋白作用的結果。在條斑紫菜的相關研究[14]中發(fā)現，PySOS1和PyNhaD(Na+/H+逆向轉運蛋白)在條斑紫菜的pH調節(jié)和Na+穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著重要的作用。在壇紫菜的轉錄組學研究中同樣篩選到編碼Na+/H+逆向轉運蛋白的基因[2]，但其功能尚待進一步驗證。文獻[3]表明，鹽度110下，壇紫菜葉狀體Na+大量外排，且流速基本維持在20 000 pmol·cm-2·s-1左右，加入阿米洛利能夠顯著抑制Na+的外排，證實了高鹽脅迫下壇紫菜Na+/H+逆向轉運蛋白的排Na+功能。而本研究中，在低鹽脅迫下，壇紫菜葉狀體同樣能通過Na+的外排來積極適應外界的滲透環(huán)境(見圖1a)；在鹽度5的基礎上加入阿米洛利后，并不能顯著抑制壇紫菜葉狀體Na+的外排(見圖1d)。這表明低鹽下葉狀體Na+的外排方式可能和高鹽不一致，可能通過非選擇性陽離子通道外排至細胞外[15-16]。

耐鹽植物在鹽脅迫條件下可以維持較高的K+含量以保持酶活性[9,17]，保證生物代謝活動正常進行。將LeNHX2基因導入番茄(Solanumlycopersicum)后，能夠改善鹽脅迫下K+的流失，進而增強耐鹽性[18]。生長于低鹽中的長囊水云(Ectocarpussiliculosus)能夠減少Na+，維持K+以應對水中滲透壓的變化[19]。低鹽脅迫會導致龍須菜(AsparagusschoberioidesKunth)細胞間孔狀聯系受到破壞，但低鹽脅迫對龍須菜細胞內K+含量影響不大，表明龍須菜具有較強的耐低鹽性[20]。以上研究均表明，鹽脅迫下維持較高的K+離子含量對植物耐鹽起著至關重要的作用。文獻[3]發(fā)現，低鹽脅迫下壇紫菜葉狀體內的K+含量雖有流失但仍維持在較高水平，顯著高于高鹽脅迫下葉狀體的K+含量，初步說明在低鹽條件下壇紫菜葉狀體具有更強的保K+能力。進一步通過轉錄組分析發(fā)現，K+外向通道在低鹽脅迫下并未出現差異表達[2]，同時，添加TEA抑制K+外向通道以及添加釩酸鈉抑制質膜質子泵活性后，壇紫菜葉狀體的K+含量均為未發(fā)生明顯變化[3]。這說明低鹽條件下壇紫菜葉狀體內的K+并不是通過去極化激活的外向通道流失的，與壇紫菜應答高鹽脅迫過程中K+流失方式有所區(qū)別，有可能是通過非選擇性陽離子通道流失。但由于缺少特異抑制劑，本研究并未添加相應離子通道抑制劑測定藻體K+流速變化。正常狀態(tài)下，壇紫菜為了維持自身滲透壓和離子平衡，會吸收K+；低鹽脅迫下添加質膜H+-ATPase抑制劑釩酸鈉后，對K+離子的外排并無顯著影響(見圖2c)。這初步說明質膜H+-ATPase對K+在低鹽下的運輸并無顯著作用。S5組在低鹽脅迫下，壇紫菜K+雖有微弱流失(見圖2a)，但顯著低于高鹽脅迫條件下的K+外排幅度。這表明壇紫菜具有較強的保K+能力。低鹽脅迫下較強的維持K+穩(wěn)定的能力使壇紫菜具有較高的K+/Na+比，保證了壇紫菜較強的耐低鹽性。

此外，H+-ATPase是一種廣泛存在于植物各個細胞膜中的重要蛋白[21]，質膜H+-ATPase能夠為跨膜運輸提供能量[22]，從而為Na+/H+逆向轉運蛋白提供驅動力。大量研究[23-24]表明在不同物種中質膜H+-ATPase有助于Na+外排。文獻[3]發(fā)現，高鹽脅迫下，H+呈現外排趨勢，從而驅動Na+/H+逆向轉運蛋白外排Na+，同時，緩解質膜去極化進而減少K+通過外向通道流失。但在低鹽脅迫下， H+微弱內流(見圖3)，進一步表明壇紫菜響應低鹽脅迫和高鹽脅迫之間存在顯著差異。

4 結論

壇紫菜葉狀體在低鹽脅迫下通過快速排出Na+離子，以積極應對外界低滲環(huán)境；同時，低鹽脅迫下K+雖然有一定的流失，但顯著低于高鹽脅迫下的K+外排幅度。這表明壇紫菜葉狀體具有較強的保K+能力，因此能夠維持較高的細胞內K+/Na+比，從而提高壇紫菜葉狀體抵抗低鹽脅迫的能力。進一步分析發(fā)現，壇紫菜葉狀體排Na+保K+過程并不是質膜Na+/H+逆向轉運蛋白和質膜H+-ATPase共同作用的結果。因此，高鹽脅迫和低鹽脅迫條件下，壇紫菜葉狀體采取不同機制來維持離子平衡。本研究為闡明壇紫菜葉狀體的耐低鹽機理提供了新的依據和見解。