擬穴青蟹細絲蛋白C的生物信息學分析及重組表達

何欣蓉,楊 陽,張永霞,劉 紅,曹敏杰,劉光明

(1．集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2．水產品深加工技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021；3．廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建 廈門 361021)

0 引言

蟹類作為一種營養(yǎng)價值高、肉質鮮美的水產品，廣受消費者喜愛。但是，蟹類引起的食物過敏發(fā)病率卻持續(xù)上升，成為了人們廣泛關注的食品安全問題之一[1]。目前，擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)中已有多種致敏原被發(fā)現并鑒定[2-8]。細絲蛋白是3種肌動蛋白交聯(lián)蛋白，迄今已發(fā)現3種細絲蛋白亞型，即細絲蛋白A、細絲蛋白B和細絲蛋白C(filamin C,FLN c)[9-12]。3種亞型之間具有60%～80%同源性，僅兩個鉸鏈區(qū)差別較大。FLN c在克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)及擬穴青蟹中被分離鑒定為新型過敏原，且在克氏原螯蝦中，FLN c與磷酸丙糖異構酶間具有免疫交叉反應[13]。FLN c作為擬穴青蟹的新型致敏原，YANG等[8]通過噬菌體展示技術淘選得到了7個線性表位及6個構象表位。目前，抗原表位與FLN c結構之間構效關系不明確，也未有相關晶體結構報道。天然FLN c純化步驟繁瑣，成本較高，得率較低，使得相關研究難以深入。在無法獲得蛋白質的情況下，生物信息學分析[14-16]為蛋白質的理化性質及空間結構的分析提供了理論依據，它把基因組DNA序列信息分析作為源頭，在獲得蛋白質編碼區(qū)的信息后進行蛋白質空間結構模擬和預測[17-18]。

蛋白質結構預測研究現狀還不能完全滿足實際需要，真正地解決這一問題還得從蛋白質自身入手，因此，獲得大量純化的蛋白質顯得尤為重要。原核表達能夠短時間內獲得基因表達產物，而且所需的成本相對比較低廉，方法簡單，可以表達的蛋白質也比較多。麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein，MBP)標簽可以促進蛋白質的可溶性和正確折疊，增加蛋白質表達量和穩(wěn)定性，并且可實現簡單親和純化，彌補了原核表達常以包涵體形式表達而導致產物純化困難和蛋白質穩(wěn)定性差的缺陷[19-20]。但由于FLN c具有較大的相對分子質量(90 ku)，利用原核表達系統(tǒng)獲得正確折疊的蛋白質難度較大，難以獲得完整晶體，使得FLN c結構解析相關研究進展緩慢。本文通過生物信息學分析確定擬穴青蟹FLN c分段重組表達的區(qū)域，純化鑒定出帶有MBP標簽的重組表達蛋白，并進行IgE結合能力分析，定位擬穴青蟹FLN c的抗原表位區(qū)域，獲得的分段表達蛋白也可用于晶體學研究，并為過敏組分診斷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鮮活的擬穴青蟹購自廈門市集美新華都購物廣場，取蟹腳與蟹鉗部分肌肉組織，其中80 g用于純化天然FLN c，100 mg用于提取RNA，其余置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

甲殼類過敏患者血清(編號分別為 982509、879857、859809、892787、739647、722791)由廈門大學附屬婦女兒童醫(yī)院提供(倫理審查編號：KY-2019-014)，所有血清分裝后于-30 ℃冰箱保存?zhèn)溆?實驗所用血清均為血清池)。SDS-PAGE所用的標準蛋白購自Fermentas公司，Western-blotting所用的預染標準蛋白購自New England Biolab公司，硝酸纖維素膜購自Amersham公司，羊抗兔HRP-IgG購自Dako公司，羊抗人HRP-IgE購自KPL公司，牛血清白蛋白購自Sigma公司，化學發(fā)光試劑購自Alpha Innotech公司，兔抗擬穴青蟹FLN c多克隆抗體由本實驗室制備，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析

利用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在線服務器分析擬穴青蟹FLN c的二級結構；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)及NCBI Conserved Domain Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)確定擬穴青蟹FLN c的結構域，并于蛋白質數據庫(protein data bank,PDB，http://www.rcsb.org/)中選擇同源性較高的模板，在SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)上進行同源建模，并將輸出的PDB模型在PyMOL軟件上進行分析。預測結果中，全球模型質量評估(global model quality estimate，GMQE)可信度范圍為0～1，定性模型能量分析(qualitative model energy analysis，QMEAN)可信度范圍為-4～0。

1.2.2 擬穴青蟹總RNA提取和RT-PCR擴增目的基因片段

RNA提取步驟參考總RNA提取試劑盒說明書進行，檢測提取的RNA濃度及純度后，將其在-70 ℃保存?zhèn)溆?。cDNA按PrimeScript TM Ⅱ 1st Strand cDNA合成試劑盒說明書合成[21]。

1.2.3 擬穴青蟹FLN c引物設計及合成

根據Genbank中檢索的擬穴青蟹FLN c基因序列(編號 MK747241.1)，并結合生物信息學分析，利用 Primer 5.0軟件設計分段表達引物，確定3對PCR反應引物(FLN c1、FLN c2、FLN c3)及 3 對帶有SalⅠ/NotⅠ酶切位點及保護堿基的表達引物(rFLN c1、rFLN c2、rFLN c3)，實驗所用引物由上海鉑瑞生物技術有限公司合成，如表1所示。

表1 FLN c引物序列

1.2.4 擬穴青蟹FLN c的重組表達

構建FLN c分段克隆載體pEASY-T1-FLN c-1、pEASY-T1-FLN c-2、pEASY-T1-FLN c-3，將測序正確的質粒、帶有MBP標簽及6個His標簽的V29H載體質粒分別用SalⅠ/NotⅠ雙酶切處理，用T4 DNA連接酶將目的基因片段與載體酶切產物于16 ℃連接18 h以上，并轉化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中。重組蛋白表達方法參考文獻[22]，收集所得全菌液、上清液及沉淀，利用SDS-PAGE(以空載體誘導物作為對照)鑒定誘導表達結果。

1.2.5 重組蛋白的鑒定及純化

Western-blotting 采用林江偉等[23]的方法，以兔抗擬穴青蟹FLN c抗體(1∶50 000稀釋)作為一抗孵育2 h，羊抗兔HRP-IgG(1∶2 000稀釋)作為二抗孵育1 h，天然擬穴青蟹FLN c作為陽性對照，化學發(fā)光法顯色。將鑒定結果正確的陽性轉化子大量表達，由于重組蛋白帶有His標簽，因此將破碎離心所得上清液上樣于鎳柱純化，收集目的蛋白后，將咪唑緩沖液置換為20 mmol/L Tris-HCl緩沖液。

1.2.6 重組蛋白的IgE結合活性分析

以蟹類過敏患者血清池(1∶4 稀釋)作為一抗，羊抗人HRP-IgE(1∶2 000 稀釋)作為二抗，利用Western-blotting分析重組蛋白與甲殼類過敏患者血清IgE結合情況，陽性對照為天然擬穴青蟹FLN c，陰性對照為牛血清蛋白(蛋白質質量濃度均為0.5 g/L，緩沖液濃度均為20 mmol/L Tris-HCl)。以非過敏患者血清池作為對照組。

2 結果與分析

2.1 擬穴青蟹FLN c的二級結構及結構域分析

通過分析擬穴青蟹天然FLN c一級結構，利用在線分析軟件對FLN c二級結構進行預測分析，結果如圖1所示。由圖1可見，擬穴青蟹FLN c的二級結構元件主要有β-折疊(52.4%)和無規(guī)則卷曲(42.6%)，α-螺旋的含量極少。蛋白質結構域是在較大的蛋白質分子中，由于多肽鏈上相鄰的超二級結構緊密聯(lián)系，故形成兩個或多個在空間上可以明顯區(qū)別的局部區(qū)域。結構域是介于二級和三級結構之間的一種結構層次，是蛋白質三級結構的基本結構單位。由于FLN c較大的分子質量，難以確定抗原表位及關鍵氨基酸位置，因此，通過劃分結構域來了解該蛋白質的三維結構。利用SMART及NCBI Conserved Domain Search確定擬穴青蟹FLN c的結構域組成分布情況，結果如表2所示，兩種軟件預測結構域分布相似，因此可判斷FLN c由9個結構域組成。

2.2 擬穴青蟹FLN c的三級結構分析

由于未有相關細絲蛋白完整晶體結構的報道，因此在掌握蛋白質一級結構前提下，可以利用SWISS-MODEL在線同源建模和PyMOL軟件對三級模型進行分析?；贔LN c結構域的組成，將FLN c分為9部分(Domain 1～9)，在PDB中使用同源性較高的人FLN a(ID：2K7P、2K7Q、4P3W)及人FLN c(ID：1V05)的X射線晶體結構分別作為模板生成擬穴青蟹FLN c的同源模型結構。PyMOL軟件的輸出圖如圖2所示。

表2 FLN c的結構域預測Tab.2 Domain prediction of FLN c結構域Domain氨基酸位置Amino acid positionSMARTConserverd domain search12-482-52255-15258-1513155-240181-2344244-335245-3345340-433377-4266437-528438-5287531-623530-6178626-716627-7159756-845757-844

由圖2可見，擬穴青蟹FLN c的3部分的三級結構均是由首尾相連的結構域組成的單體，每個單體由一個位于N末端的肌動蛋白結合域和一個由許多重復片段組成的C末端桿狀結構域組成。桿狀區(qū)的每一個重復序列由約100個殘基組成，形成免疫球蛋白樣折疊，具有典型的細絲蛋白家族特征。在X射線結構包含的區(qū)域中，擬穴青蟹FLN c的核心結構域與模板氨基酸序列同一性，EMQE與QMEAN可信度如表3所示，EMQE可信度與QMEAN可信度均在理想范圍內，表明同源模型結構質量良好。

表3 FLN c的同源建模數據分析

2.3 擬穴青蟹FLN c的分段表達及產物鑒定

對FLN c一系列的生物信息學分析，并根據氨基酸數目將FLN c分為3部分進行分段重組表達(Domain 1～4、Domain 5～6、Domain 7～9)，定位FLN c抗原表位優(yōu)勢區(qū)。將測序正確的陽性轉化子于37 ℃誘導表達4 h，結果如圖3a所示，陽性轉化子均可在上清液中表達，表觀相對分子質量分別為77，63，75 ku。為了鑒定重組蛋白，分別挑選表達量較高的1、6、12號陽性轉化子的重組蛋白上清液與擬穴青蟹FLN c多克隆抗體結合，結果如圖3b所示，重組蛋白上清液均能與抗體特異性結合，說明表達的重組蛋白即為擬穴青蟹rFLN c1、rFLN c2、rFLN c3。

2.4 表達蛋白的純化及IgE結合活性分析

為了測定FLN c的分段表達產物致敏性差異，定位抗原表位所在結構域，將rFLN c1、rFLN c2、rFLN c3分別進行純化，并用蟹類過敏患者血清驗證其IgE結合活性，結果如圖4所示。由圖4a、圖4b、圖4c、圖4d可見，重組蛋白均能用鎳柱純化后得到單一蛋白條帶。純化蛋白的血清學分析如圖4e所示，根據箭頭分別指出的重組蛋白的免疫印跡可知，rFLN c2的血清比rFLN c1、rFLN c3有較強的IgE結合能力，即rFLN c2的致敏性最強，rFLN c1的致敏性最弱，而非過敏患者血清池與重組蛋白未發(fā)生反應(見圖4f)。

3 討論

本研究首先通過一系列生物信息學分析手段，預測了擬穴青蟹FLN c的二級結構，結果與克氏原螯蝦天然FLN c二級結構相似。通過預測擬穴青蟹FLN c結構域組成，發(fā)現其具有9個結構域。由于數據庫缺乏細絲蛋白家族的完整晶體結構數據，因此通過其結構域組成將擬穴青蟹FLN c以人FLN a、FLN c的不同結構域的晶體結構同源建模，分別模擬了FLN c的空間結構。結果顯示，擬穴青蟹FLN c的模擬三級結構均是由首尾相連的結構域組成的單體，結構相似且Domain 1與Domain 2、Domain 3與Domain 4、Domain 5與Domain 6、Domain 7與Domain 8之間緊密連接，對FLN c的三維結構研究提供一定的理論參考。由于缺少甲殼類水產品FLN c相關模板，利用人細絲蛋白家族作為模板與擬穴青蟹FLN c物種同源性差異較大，導致難以精準預測擬穴青蟹FLN c的三級結構，無法實現其抗原表位的定位[7,24]。然而，天然FLN c熱穩(wěn)定性弱，容易降解，且較難通過原核表達使得重組FLN c正確折疊，目前尚未得到適用于晶體學分析的蛋白質。

為了獲得表達量大、可溶性強的FLN c重組蛋白，通過其關鍵致敏區(qū)域定位抗原表位優(yōu)勢區(qū)，基于FLN c空間結構預測等生物信息學分析，并參考氨基酸組成數量，將FLN c分為Domain 1～4、Domain 5～6及Domain7～9等3部分，對FLN c進行了分段重組表達。由于載體帶有相對分子質量為40 ku的MBP融合蛋白，使得重組蛋白rFLN c1、rFLN c2、rFLN c3的表達量及溶解性明顯增強[19-20]，表達于上清液中證明蛋白質的正確折疊，同時導致目的蛋白的分子質量偏大。利用擬穴青蟹FLN c的多克隆抗體對目的蛋白鑒定，結果表明，特異性抗體均可識別目的蛋白，其中rFLN c3的IgG結合能力較弱，可能的原因是由于此結構域中IgG結合表位較少。另外，為了避免載體中雜蛋白對重組蛋白致敏性的影響，分別純化得到了單一重組蛋白，并且純化方法簡單，得率高。血清學分析結果顯示，rFLN c2與蟹過敏患者血清IgE結合能力最強，而之前所報道的抗原表位中rFLN c1含有1個線性表位及1個構象表位，rFLN c2含有3個線性表位及2個構象表位，rFLN c3含有3個線性表位及3個構象表位[8]。由于血液樣本數量少，可能導致未淘選得到所有表位，且選用人體虱FLN c為模板，使得到的表位信息存在偏差。由此推測，rFLN c2可能含有更多表位，并且在FLN c構象表位淘選過程中，識別rFLN c2區(qū)域的構象表位的過敏患者血清IgE最多。綜上，推斷氨基酸336-531結構域中的抗原表位是蟹類過敏患者血清主要識別的表位區(qū)域。此外，rFLN c2與人FLN a空間結構的擬合度最高，均為單體，其分子質量較小且相關性質穩(wěn)定，容易獲得晶體，因此可以通過rFLN c2得到部分FLN c晶體，從而推測出FLN c的完整晶體結構。

4 結論

本研究通過生物信息學分析，預測了擬穴青蟹FLN c的高級結構，利用原核表達獲得了rFLN c1、rFLN c2和rFLN c3，血清學實驗表明，氨基酸336-531結構域可能是抗原表位優(yōu)勢區(qū)。另外，rFLN c2可用于FLN c的晶體學研究，為過敏組分診斷提供理論依據。