14-3-3-zeta在Ⅲ/Ⅳ期套細(xì)胞淋巴瘤患者中的表達(dá)及其臨床意義

朱米娜，王健紅，郝彩霞，王文勇，張 娜，賈衛(wèi)靜，唐海龍，董寶俠，顧宏濤，張 濤，楊 嵐，高廣勛，陳協(xié)群，王 哲，梁 蓉*

(1西安市第一醫(yī)院急診科，西安 710002；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院：2血液科，3病理科，西安 710032)

套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)是一種B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)，約占NHL的3%～10%，異質(zhì)性強(qiáng)，好發(fā)于老年男性，患者就診時(shí)常為Ⅲ～Ⅳ期，易復(fù)發(fā)，預(yù)后差[1-4]。目前多采用淋巴瘤國(guó)際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index, IPI)和MCL國(guó)際預(yù)后指數(shù)(MIPI)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層[5,6]，但仍難以準(zhǔn)確指導(dǎo)MCL臨床治療和預(yù)后評(píng)估，亟需探討新的預(yù)后判斷指標(biāo)。

14-3-3zeta屬14-3-3蛋白家族成員，可通過(guò)結(jié)合蛋白發(fā)揮對(duì)多種網(wǎng)絡(luò)信號(hào)的調(diào)控，如Bax、Bad與14-3-3zeta結(jié)合后定位在胞漿內(nèi)，通過(guò)阻斷它們與線粒體Bcl-2的結(jié)合發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[7-9]。有研究表明14-3-3zeta與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[10]，目前未出現(xiàn)其在MCL表達(dá)的研究報(bào)道。本研究旨在探討14-3-3-zeta的表達(dá)及其與MCL患者預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2007年3月至2012年3月期間于第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院取材、病理科確診、血液科住院標(biāo)準(zhǔn)治療的，并取得完整2年隨訪資料的12例MCL患者的臨床資料，包括：性別、發(fā)病年齡、發(fā)病部位、全身癥狀、美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Group, ECOG)評(píng)分、腫大淋巴結(jié)、脾臟及骨髓侵犯、其他結(jié)外侵犯、臨床分期、發(fā)病時(shí)的白細(xì)胞數(shù)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-GM)、病理結(jié)果、治療方案。所有患者均接受1個(gè)療程以上CHOP(E)方案{多柔比星(doxorubicin)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、潑尼松[prednisone；依托泊苷(etoposide)]}±R[利妥昔單抗(rituximab)]聯(lián)合化療，2例同時(shí)行局部放療。1例經(jīng)化療+局部放療達(dá)完全緩解(complete remission, CR)后行自體造血干細(xì)胞移植(autologous stem-cell transplantation, ASCT)；1例選用PAD方案[硼替佐米(bortezomib)、多柔比星、地塞米松(dexamethasone)]聯(lián)合化療，達(dá)CR后采用美羅華(利妥昔單抗注射液)1次/月維持治療。所有方案藥物劑量均參照美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南MCL治療方案的標(biāo)準(zhǔn)劑量，按體表面積計(jì)算得出?；颊咄瓿?～6個(gè)療程正規(guī)化療后，評(píng)定短期療效總反應(yīng)率(overall response rate,ORR)，包括CR和部分完全緩解(partial remission,PR)；隨訪2年，觀察總生存(overall survival,OS)率及無(wú)進(jìn)展生存(progression free survival,PFS)率。

調(diào)取患者存檔蠟塊，重新切片、固定，經(jīng)免疫組化檢測(cè)蛋白表達(dá)，以15份淋巴結(jié)反應(yīng)性增生標(biāo)本作為對(duì)照。

1.2 主要試劑與儀器

14-3-3zeta，兔抗人多克隆抗體(Abcam公司，英國(guó))；CD20、CD10、CD79α、Bcl-2、GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(DAKO公司，丹麥)；CD5、CD3、PAX5、Cyclin D1(邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，福州)。顯微鏡及成像系統(tǒng)(Olympus公司，日本)。

1.3 常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色

12例患者病理活檢標(biāo)本經(jīng)HE染色、光鏡下觀察。采用抗原抗體反應(yīng)原理，用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶二步法檢測(cè)免疫表型：一抗14-3-3zeta 濃度為1︰ 50，開(kāi)始免疫組織化學(xué)染色前抗原經(jīng)微波修復(fù)10 min。采用磷酸緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，并采用試劑盒建議的陽(yáng)性對(duì)照片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

兼顧陽(yáng)性染色強(qiáng)度與數(shù)量進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定。以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)記。(1)根據(jù)染色強(qiáng)度分為0分(無(wú)色)、1分(淺黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)；(2)根據(jù)腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞百分比分為0分(無(wú)陽(yáng)性)、1分(≤25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(>75%)；(3)染色強(qiáng)度積分與數(shù)量積分相加后判定結(jié)果：0分為-，1分為±；2～3分為+，4～5分為++，6～7分為+++。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間比較采用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況

12例患者中男性9例，女性3例，男︰女=3︰1，中位年齡57.5(45～74)歲，病理類型均為彌散性。臨床特點(diǎn)具體見(jiàn)表1。

2.2 14-3-3zeta在MCL中的表達(dá)及臨床意義

14-3-3zeta在反應(yīng)性增生淋巴結(jié)中弱表達(dá)。12例 MCL患者中8例細(xì)胞漿中14-3-3zeta陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%(表1，圖1)。

14-3-3zeta陽(yáng)性表達(dá)患者ORR(62.5%，8例患者中5例緩解)與陰性表達(dá)患者(75.0%，4例患者中3例緩解)相比，無(wú)明顯差異；14-3-3zeta陽(yáng)性表達(dá)患者2年P(guān)FS率(37.5%，8例患者中3例無(wú)進(jìn)展)低于陰性表達(dá)患者(75.0%，4例患者中3例無(wú)進(jìn)展)；14-3-3zeta陽(yáng)性表達(dá)患者2年OS率(50.0%，8例患者中4例存活)低于陰性表達(dá)患者(100%，4例患者全部存活)。由于樣本量太小，上述結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 12例MCL患者14-3-3zeta的表達(dá)

MCL: mantle cell lymphoma; IPI: international prognostic index; MIPI: mantle cell lymphoma international prognostic index; LDH: lactate dehydrogenase; F: female; M: male;*ND:not done;▲N: lymph node

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)14-3-3zeta在MCL的表達(dá)

8例14-3-3zeta陽(yáng)性患者中5例Bcl-2陽(yáng)性；7例Bcl-2陽(yáng)性患者中5例14-3-3zeta陽(yáng)性(71.4%)，兩者表達(dá)有相關(guān)性(表1)。14-3-3zeta與Bcl-2均表達(dá)陽(yáng)性者5例，4例治療有效(ORR)，2例達(dá)2年P(guān)FS，2例達(dá)2年長(zhǎng)生存；14-3-3zeta與Bcl-2其中之一表達(dá)陽(yáng)性者2例，均治療有效(ORR)，1例達(dá)2年P(guān)FS，2例達(dá)2年長(zhǎng)生存。8例14-3-3zeta陽(yáng)性患者中3例行R+CHOP(E)方案化療，2例治療有效(ORR)，2例達(dá)2年P(guān)FS，3例達(dá)2年長(zhǎng)生存；5例行CHOP(E)方案化療，3例治療有效(ORR)，1例達(dá)2年P(guān)FS，1例達(dá)2年長(zhǎng)生存。結(jié)果提示,14-3-3zeta與Bcl-2表達(dá)均陽(yáng)性者療效較單一陽(yáng)性表達(dá)者差，R+CHOP(E)方案組療效優(yōu)于CHOP(E)方案組，有臨床意義，但樣本量少，尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

3 討 論

MCL是一種相對(duì)少見(jiàn)的、具有高度異質(zhì)性的特殊類型NHL，兼有侵襲性淋巴瘤和惰性淋巴瘤的特征，還具有特征性的遺傳學(xué)易位特點(diǎn)t(11;14)(q13;q32)，并導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1過(guò)度表達(dá)。MCL中位生存期3～5年，預(yù)后受多種因素影響，目前多采用IPI和MIPI進(jìn)行預(yù)后評(píng)估[5,6]，但仍難以準(zhǔn)確地指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后評(píng)估，亟需探討新的預(yù)后判斷指標(biāo)。本研究旨在初步探討新的分子14-3-3zeta蛋白在MCL表達(dá)中的意義，指導(dǎo)臨床診療。

本研究12例患者中男性9例，女性3例，男︰女=3︰1，中位年齡57.5(45～74)歲。Ann Arbor臨床分期均為Ⅲ～Ⅳ期；淋巴結(jié)起病8例(占66.7%)；脾臟受累9例(占75.0%)；骨髓侵犯7例(占58.3%)；伴隨全身癥狀者5例(占41.7%)；所有患者病理類型均為彌散型；IPI 0～2分(中低危)的患者約占66.7%；MIPI<5.7(中低危)的患者約占63.6%。

14-3-3zeta是14-3-3蛋白家族的一個(gè)亞型，可通過(guò)Bad、Bax和Noxa、細(xì)胞骨架蛋白、CDC25C、HDACs和組蛋白等結(jié)合蛋白發(fā)揮對(duì)多種網(wǎng)絡(luò)信號(hào)的調(diào)控，如Noxa與Mcl-1蛋白結(jié)合能促進(jìn)Mcl-1蛋白降解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；14-3-3zeta/Noxa結(jié)合可能通過(guò)Mcl-1而抑制凋亡。14-3-3 zeta與Bax和Bad結(jié)合后定位在胞漿內(nèi)，通過(guò)阻斷它們與線粒體Bcl-XL和Bcl-2的結(jié)合發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[7,8]。14-3-3zeta參與多種癌癥細(xì)胞的增殖、周期調(diào)控、黏附、生長(zhǎng)和凋亡等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[9,11-13]。研究顯示下調(diào)14-3-3zeta表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療敏感性，可能是潛在的未來(lái)腫瘤治療的新靶點(diǎn)[9,14,15]。Maxwell等[10]的研究表明14-3-3zeta與DLBCL的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，并且提出了針對(duì)耐藥性DLBCL使用14-3-3抑制劑這樣一種有前景的綜合治療方案。目前未出現(xiàn)14-3-3zeta在MCL表達(dá)的臨床意義的體內(nèi)外研究報(bào)道。

我們研究表明，12例患者14-3-3zeta 表達(dá)陽(yáng)性8例(66.7%)，71.4%的Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性者14-3-3zeta表達(dá)陽(yáng)性，符合正相關(guān)，且兩者均表達(dá)陽(yáng)性者的ORR、2年P(guān)FS/ OS率均較單一陽(yáng)性表達(dá)者差。進(jìn)行預(yù)后因素分析結(jié)果如下。(1)14-3-3zeta陽(yáng)性表達(dá)患者ORR、2年OS率、2年P(guān)FS率(62.5%、50.0%、37.5%)均低于14-3-3zeta陰性表達(dá)患者(75.0%、100.0%、75.0%)。(2)8例14-3-3zeta陽(yáng)性患者中3例行R+CHOP(E)方案化療，2例治療有效(ORR)，2例達(dá)2年P(guān)FS，3例達(dá)2年長(zhǎng)生存；5例行CHOP(E)方案化療，3例治療有效(ORR)，1例達(dá)2年P(guān)FS，1例達(dá)2年長(zhǎng)生存。提示R+CHOP(E)方案組的ORR、2年P(guān)FS/ OS率均優(yōu)于CHOP(E)方案組，表明利妥昔單抗聯(lián)合化療可提高療效，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[16,17]。兩個(gè)方案的療效差異雖有臨床意義，但樣本量少，尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

以上結(jié)果提示，14-3-3zeta蛋白可能與MCL預(yù)后有一定關(guān)系；而14-3-3zeta與Bcl-2表達(dá)符合正相關(guān)，推測(cè)14-3-3zeta與MCL預(yù)后相關(guān)性原因與Bcl-2有關(guān)，可能是MCL治療的新靶點(diǎn)。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Goy A. Update in the management of mantle cell lymphoma[J]. Clin Adv Hematol Oncol, 2013, 11(5): 297-299.

[2] Skarbnik AP, Smith MR. Therapies for mantle cell lymphoma: current challenges and a brighter future[J]. Discov Med, 2013, 15(82): 177-187.

[3] Brett K, Williams ME. Current and emerging therapies in mantle cell lymphoma[J]. Curr Treat Options Oncol, 2013, 14(2): 198-211.

[4] Dreyling M, Geisler C, Hermine O,etal. Newly diagnosed and relapsed mantle cell lymphoma: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up[J]. Ann Oncol, 2014, 25 (suppl 3): iii83-iii92.

[5] Hoster E, Dreyling M, Klapper W,etal. A new prognostic index (MIPI) for patients with advanced-stage mantle cell lymphoma[J]. Blood, 2008, 111(2): 558-565.

[6] McKay P, Leach M, Jackson R,etal. Guidelines for the investigation and management of mantle cell lymphoma[J]. Br J Haematol, 2012, 159(4): 405-426.

[7] Gardino AK, Yaffe MB. 14-3-3 proteins as signaling integration points for cell cycle control and apoptosis[J].Semin Cell Dev Biol, 2011, 22(7): 688-695.

[8] Tromp JM, Geest CR, Breij EC,etal. Tipping the Noxa/Mcl-1 balance overcomes ABT-737 resistance in chronic lymphocytic leukemia[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(2): 487-498.

[9] Yang X, Cao W, Zhang L,etal. Targeting 14-3-3zeta in cancer therapy[J]. Cancer Gene Ther, 2012, 19(3): 153-159.

[10] Maxwell SA, Li Z, Jaye D,etal.14-3-3zeta mediates resistance of diffuse large B cell lymphoma to an anthracycline-based chemotherapeutic regimen[J]. J Biol Chem, 2009, 84(33): 22379-22389.

[11] Matta A, Siu KW, Ralhan R. 14-3-3 zeta as novel molecular target for cancer therapy[J]. Expert Opin Ther Targets, 2012, 16(5): 515-523.

[12] Chen M, Liu T, Xu L,etal. Direct interaction of 14-3-3ζ with ezrin promotes cell migration by regulating the formation of membrane ruffle[J]. J Mol Biol, 2014, 426(18): 3118-3133.

[13] Uhart M, Bustos DM. Protein intrinsic disorder and network connectivity. The case of 14-3-3 proteins[J]. Front Genet, 2014, 5: 10.

[14] Bergamaschi A, Katzenellenbogen BS. Tamoxifen down regulation of miR-451 increases 14-3-3ζ and promotes breast cancer cell survival and endocrine resistance[J]. Oncogene, 2012, 31(1): 39-47.

[15] Toyo-Oka K, Wachi T, Hunt RF,etal. 14-3-3ε and ζ regulate neurogenesis and differentiation of neuronal progenitor cells in the developing brain[J]. J Neurosci, 2014, 34(36): 12168-12181.

[16] Armand P, Redd R, Bsat J,etal. A phase 2 study of Rituximab-Bendamustine and Rituximab-Cytarabine for transplant-eligible patients with mantle cell lymphoma[J]. Br J Haematol, 2016, 173(1): 89-95.

[17] Bao WY, Wang Y, Hu XM,etal. Clinical features and prognostic analysis of mantle cell lymphoma[J]. Chin J Hematol, 2012, 33(10): 814-818.[包維鶯, 王 焰, 胡喜梅, 等. 套細(xì)胞淋巴瘤的臨床特點(diǎn)及預(yù)后分析[J]. 中華血液學(xué)雜志, 2012, 33(10): 814-818.]