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    瑪咖石油醚提取物抗疲勞的影響及組分分析

    2016-04-18 01:55:40楊秦呂學(xué)遠(yuǎn)代鵬飛余龍江金文聞華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院資源生物學(xué)與生物技術(shù)研究所湖北武漢40074華中師范大學(xué)體育學(xué)院湖北武漢40079武漢華士特工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)有限公司湖北武漢40074
    食品研究與開發(fā) 2016年3期
    關(guān)鍵詞:能量代謝抗疲勞

    楊秦,呂學(xué)遠(yuǎn),代鵬飛,余龍江,金文聞,*(.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,資源生物學(xué)與生物技術(shù)研究所,湖北武漢40074;2.華中師范大學(xué)體育學(xué)院,湖北武漢40079;.武漢華士特工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)有限公司,湖北武漢40074)

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    瑪咖石油醚提取物抗疲勞的影響及組分分析

    楊秦1,2,呂學(xué)遠(yuǎn)1,代鵬飛3,余龍江1,金文聞1,*
    (1.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,資源生物學(xué)與生物技術(shù)研究所,湖北武漢430074;2.華中師范大學(xué)體育學(xué)院,湖北武漢430079;3.武漢華士特工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)有限公司,湖北武漢430074)

    摘要:利用長時(shí)間游泳制備小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型,探討瑪咖石油醚提取物對抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的功效及可能機(jī)制。結(jié)果顯示,補(bǔ)充瑪咖石油醚提取物可以顯著延長負(fù)重力竭游泳時(shí)間,顯著降低血乳酸、血氨和血乳酸脫氫酶,增加非酯化脂肪酸和肝糖原含量,而血尿素氮和血糖無顯著性差異。高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜分析顯示瑪咖石油醚提取物含有脂肪酸和約20%瑪咖酰胺。

    關(guān)鍵詞:瑪咖;石油醚提取物;抗疲勞;能量代謝

    運(yùn)動(dòng)性疲勞是體內(nèi)一個(gè)復(fù)雜的生理生化變化過程,代謝失調(diào)能導(dǎo)致疲勞的產(chǎn)生[1]。代謝失調(diào)包括能源物質(zhì)的消耗如糖原和葡萄糖,以及代謝產(chǎn)物的積累如乳酸、尿素氮、氨等[2]。有很多方法可以緩解疲勞,而補(bǔ)充無毒副作用的天然活性物質(zhì)是營養(yǎng)學(xué)家、運(yùn)動(dòng)生理學(xué)家不斷尋找的緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的方法之一。

    瑪咖(Lepidium meyenii Walp.),是一種藥食兩用植物,屬于十字花科,生長在3 500 m的高寒地區(qū)[3]?,斂Ь哂泻芏嗨幚砘钚裕缭黾由?、增強(qiáng)性欲、提高精力等。已有研究發(fā)現(xiàn)二氧化碳超臨界流萃取的瑪咖脂溶性物質(zhì)能顯著提高負(fù)重游泳小鼠的力竭游泳時(shí)間[4]。本試驗(yàn)研究石油醚提取的瑪咖脂溶性成分抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的功效及可能機(jī)制,并用高效液相色譜儀和氣相色譜-質(zhì)譜儀分析了石油醚提取物中的脂溶性成分,以期為抗疲勞天然產(chǎn)品的開發(fā)找到參考。

    1 材料與方法

    1.1試劑

    瑪咖:麗江百歲坊生物科技開發(fā)有限公司;瑪咖酰胺標(biāo)準(zhǔn)品:武漢華士特工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)有限公司;石油醚、甲醇、正己烷、吐溫-80、氯化鈉、氫氧化鉀、三氟化硼、乙醚:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈、甲醇:色譜純,Tedia公司;血乳酸、血氨、血乳酸脫氫酶、非酯化脂肪酸、糖原、血尿素氮、血糖試劑盒:南京建成生物工程研究所。

    1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    Balb/c小鼠由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。5周齡雄性小鼠在動(dòng)物飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng),室內(nèi)燈光12 h明暗交替,室溫為(23±1)℃。在試驗(yàn)期間,所有小鼠允許自由攝取嚙齒類動(dòng)物飼料和蒸餾水。

    1.3儀器與設(shè)備

    1200型高效液相色譜儀:安捷倫科技公司;5975C型氣相色譜-質(zhì)譜儀:安捷倫科技公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;SB-5200DT超聲波清洗儀:寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-1600紫外分光光度儀:上海美譜達(dá)儀器有限公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī):湖南長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;三用電熱恒溫水箱:天津市泰斯特儀器有限公司;AE100分析天平:梅特勒-托利多儀器上海有限公司;YP202N電子天平:上海精密科學(xué)儀器有限公司。

    1.4方法

    1.4.1瑪咖石油醚提取物的制備

    瑪咖根被洗凈并切成薄片,干燥處理后,用粉碎機(jī)粉碎并過80目篩。干燥的瑪咖粉用12倍體積石油醚50℃磁力攪拌回流提取30 min,再超聲提取15 min,減壓抽濾得到上清液。再重復(fù)一次以上步驟,合并抽濾的上清液,并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在48℃~52℃下真空濃縮。臨用前,將濃縮后的提取物用1 %吐溫-80超聲溶解,放于4℃冰箱備用。

    1.4.2動(dòng)物分組與給藥

    小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,適應(yīng)性游泳10 min,淘汰不能游泳的小鼠,第4天進(jìn)行負(fù)重5 %力竭游泳實(shí)驗(yàn),記錄力竭游泳時(shí)間,根據(jù)小鼠的游泳能力和體重進(jìn)行分組。小鼠被分為3組,每組10只,分別是空白對照組、瑪咖石油醚提取物低劑量組(60 mg/kg·bw)和石油醚提取物高劑量組(200 mg/kg·bw)。實(shí)驗(yàn)劑量的選擇根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置。小鼠灌胃劑量為每天0.2 mL/10 g,連續(xù)灌胃21 d,空白對照組灌胃相同體積的溶媒。

    1.4.3負(fù)重游泳能力測試

    小鼠每周游泳2次,每次10 min,以習(xí)慣游泳。實(shí)驗(yàn)第14天,小鼠灌胃30 min后進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn),記錄力竭游泳時(shí)間。負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)用來評估小鼠的耐力表現(xiàn),實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[5],略有改動(dòng)。具體如下:灌胃30 min后,小鼠被放置到塑料池(80 cm×45 cm× 40 cm)中游泳,池水深度為35 cm,水溫為(27±1)℃。距離小鼠尾根部1 cm處負(fù)體重5 %的鉛皮。小鼠沉在水下10 s不能浮出水面用鼻子呼吸被認(rèn)為達(dá)到力竭狀態(tài),迅速將其撈起,并記錄力竭游泳時(shí)間。

    1.4.4血液的采集及生化指標(biāo)的測定

    負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束,小鼠繼續(xù)灌胃7 d,實(shí)驗(yàn)第21天灌胃30 min后,小鼠游泳90 min。游泳結(jié)束后,立即拔除小鼠眼球,血液從眼球后的血管叢收集。血樣靜置半小時(shí)后,4℃下3 000 r/min離心10 min,取上清,并儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱備用。血乳酸(LD)、血氨(BA)、血乳酸脫氫酶(LDH)、非酯化脂肪酸(NEFA)、肝糖原(LG)、血尿素氮(BUN)、血糖等指標(biāo)用試劑盒進(jìn)行測定。

    1.4.5瑪咖石油醚提取物脂肪酸種類檢測

    瑪咖石油醚提取物甲酯化后,用正己烷溶解。用氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS)分析樣品,色譜柱為HP-5MS柱(30 m×250 μm×0.25 μm,安捷倫科技公司)。進(jìn)樣量為0.2 μL,流速為1 mL/min,檢測器溫度為230℃。升溫程序是160℃保持2 min,然后以4℃/min升溫到180℃保持4 min,然后以10℃/min升溫到300℃保持5 min。

    1.4.6瑪咖石油醚提取物中瑪咖酰胺的含量分析

    高效液相色譜(HPLC)分析參考McCollom等[6]研究方法略作改動(dòng),簡要如下:將瑪咖脂溶性成分溶于甲醇,過0.45 μm濾膜,色譜柱為TC-C18柱(250 mm× 4.6 mm×5 μm,安捷倫科技公司),流動(dòng)相為90 %乙腈,流速為0.6 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL。檢測波長為210 nm,室溫下操作。

    1.5數(shù)據(jù)處理與分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理,所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)用單因素方差分析,組間用LSD-t檢驗(yàn)比較。P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01具有極顯著差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1對小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響

    瑪咖石油醚提取物補(bǔ)充對小鼠力竭游泳時(shí)間的影響見圖1。

    圖1瑪咖石油醚提取物補(bǔ)充對小鼠力竭游泳時(shí)間的影響Fig.1 Effects of maca-petroleum ether extract on the swimming time to exhaustion of weight-loaded mice

    空白對照組、瑪咖石油醚提取物低濃度和高濃度補(bǔ)充組的力竭游泳時(shí)間分別是(8.92±1.15)、(12.15±2.78)、(14.16±4.89)min。低濃度和高濃度補(bǔ)充組的力竭游泳時(shí)間比對照組各增加了36 %和59 %,具有顯著性差異(P < 0.05)。

    2.2對小鼠體重的影響

    記錄實(shí)驗(yàn)前體重(始重)、實(shí)驗(yàn)第7天(中重)和第14天(終重)的體重?,斂兔烟崛∥飳π∈篌w重的影響見表1,與對照組相比,小鼠體重?zé)o顯著性差異。

    表1瑪咖石油醚提取物補(bǔ)充對小鼠體重的影響Table 1 Effects of maca-petroleum ether extract on body weights in mice

    2.3對血液指標(biāo)和糖原含量的影響

    瑪咖石油醚提取物對血清參數(shù)和糖原含量的影響見表2。

    表2瑪咖石油醚提取物對血清參數(shù)和糖原的影響Table 2 Effect of maca-petroleum ether extract on serum parameters and glycogen storage in mice

    與對照組比較,瑪咖石油醚提取物高低劑量組的肝糖原(LG)顯著增加(P < 0.05),非酯化脂肪酸(NEFA)濃度顯著降低(P < 0.05)。與對照組相比,瑪咖石油醚提取物高低劑量組血乳酸(LD)和血乳酸脫氫酶(LDH)活力顯著降低(P < 0.05),血氨(BA)濃度顯著降低(P < 0.05,P < 0.01)。然而血清尿素氮(BUN)和血糖(Glucose)含量各組間沒有顯著性差異。

    2.4瑪咖石油醚提取物成分中脂肪酸種類的分析

    瑪咖石油醚提取物中脂肪酸的種類用氣相色譜分析見圖2。

    圖2瑪咖石油醚提取物的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of maca-petroleum ether extract

    由此得出瑪咖石油醚提取物包含的脂肪酸主要為亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸等。

    2.5石油醚提取物中瑪咖酰胺的種類和含量分析

    石油醚提取物中瑪咖酰胺的高效液相色譜分析見圖3。

    圖3瑪咖酰胺的高效液相色譜分析,檢測波長210 nmFig.3 High Performance Liquid chromatograms of macamides quantified at 210 nm

    提取物中瑪咖酰胺與混標(biāo)的保留時(shí)間進(jìn)行比較,其各自含量用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示瑪咖石油醚提取物含有約20 %瑪咖酰胺。其中含量較高的3種瑪咖酰胺分別是化合物1為N-芐基亞麻酰胺,占4.22 %;化合物2為N-芐基亞油酰胺,占4.59 %;化合物3為N-芐基棕櫚酰胺,占6.63 %。

    3 結(jié)論與討論

    負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)是評估體力疲勞程度的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。研究結(jié)果顯示,補(bǔ)充瑪咖石油醚提取物能顯著延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間,提示瑪咖石油醚提取物具有抗運(yùn)動(dòng)性疲勞效果。此外,瑪咖石油醚提取物中含有脂肪酸和20 %瑪咖酰胺,主要包含芐基棕櫚酰胺、芐基亞油酰胺和芐基亞麻酰胺。

    身體的運(yùn)動(dòng)耐力依賴于包括糖原在內(nèi)的能源儲(chǔ)存和代謝產(chǎn)物的積累[7]。在運(yùn)動(dòng)過程中,糖原作為重要的能源物質(zhì)用于補(bǔ)充血糖的消耗,保持血糖在生理范圍內(nèi)。增加糖原的消耗與運(yùn)動(dòng)疲勞的產(chǎn)生有一定關(guān)聯(lián)[8]。另一方面,在運(yùn)動(dòng)中增加脂肪酸的利用,可以減少糖原的消耗,增加耐力運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)[9]。非酯化脂肪酸含量的增加被認(rèn)為是肌肉中脂肪代謝的增強(qiáng)的原因[10]。研究結(jié)果顯示灌胃石油醚提取物小鼠的肝糖原(LG)和非酯化脂肪酸(NEFA)含量較對照組顯著增加(P < 0.05),而血糖水平無明顯變化。該結(jié)果提示瑪咖石油醚提取物提高運(yùn)動(dòng)耐力可能是因?yàn)樵黾又镜睦枚鴾p少了糖原的消耗。乳酸等代謝產(chǎn)物的積累是引起機(jī)體疲勞的又一原因[11]。多余的乳酸會(huì)引起pH降低,從而抑制肌肉收縮。因此快速消除乳酸對于緩解運(yùn)動(dòng)疲勞具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)灌胃瑪咖石油醚提取物組比對照組的血乳酸含量顯著性降低(P <0.05),而乳酸是碳水化合物的代謝產(chǎn)物,乳酸含量的降低與葡萄糖和糖原的利用率降低結(jié)果一致。尿素氮(BUN)和氨(BA)是運(yùn)動(dòng)中蛋白質(zhì)和氨基酸降解的產(chǎn)物。研究結(jié)果顯示瑪咖石油醚提取物顯著降低BA濃度,而各組間的血清尿素氮(BUN)沒有顯著差異。血清乳酸脫氫酶(LDH)是肌肉損傷的指標(biāo),因?yàn)長DH通常存在于肌肉細(xì)胞中并作為肌肉損傷的結(jié)果被釋放到血液中[12]。研究結(jié)果顯示補(bǔ)充瑪咖石油醚提取物的小鼠比對照組的LDH活力更低,意味著補(bǔ)充瑪咖石油醚提取物能減輕運(yùn)動(dòng)中肌肉的損傷。

    綜上結(jié)果,瑪咖石油醚提取物能延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間,對長時(shí)間運(yùn)動(dòng)小鼠能增加運(yùn)動(dòng)后肝糖原、非酯化脂肪酸含量,降低血乳酸、血氨、血乳酸脫氫酶水平,具有抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的功效,且此功效可被部分解釋為通過轉(zhuǎn)變能量代謝實(shí)現(xiàn)的。

    參考文獻(xiàn):

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    Anti-fatigue Effect of Maca Petroleum Ether Extract and Its Component Analysis

    YANG Qin1,2,Lü Xue-yuan1,DAI Peng-fei3,YU Long-jiang1,JIN Wen-wen1,*
    (1. Institute of Resource Biology and Biotechnology,College of Life Science and Technology,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430074,Hubei,China;2. School of Physical Education and Sport,Central China Normal University,Wuhan 430079,Hubei,China;3. Wuhan Huashite Industrial Biotechnology Development Co.,Ltd.,Wuhan 430074,Hubei,China)

    Abstract:This study investigated the effects of maca petroleum ether extract(MPE)on exercised-induced fatigue in mice to characterize its effective constituents and anti-fatigue mechanisms. Results suggested that supplementation with MPE could significantly extend the weight-loaded swimming time;reduce the serum lactic acid(LD),blood ammonia(BA),serum lactate dehydrogenase(LDH);increase the non-esterified fatty acid(NEFA),liver glycogen(LG)levels;nevertheless,the levels of blood urea nitrogen(BUN)and glucose were not significantly different compared with the control group. High Performance Liquid Chromatography(HPLC)and Gas Chromatography-Mass Spectrometer(GC-MS)analysis showed that MPE contained about fatty acids and 20 % macamides.

    Key words:maca;petroleum ether extract;anti-fatigue;energy metabolism

    收稿日期:2015-04-13

    *通信作者:金文聞(1976—),男(回),講師,博士,研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)研究與開發(fā)。

    作者簡介:楊秦(1981—),女(侗),講師,博士在讀,研究方向:天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。

    基金項(xiàng)目:國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(Grant No.J1103514);湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2012FFB02607)

    DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.003

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