龍葵多糖對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

鄭岳，孫偉，盧坤玲，鄭繼堯，王益民，李健( 秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000； 燕山大學(xué))

?

·基礎(chǔ)研究·

龍葵多糖對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

鄭岳1，孫偉1，盧坤玲1，鄭繼堯1，王益民1，李健2(1 秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000；2 燕山大學(xué))

摘要：目的探討龍葵多糖對四氯化碳(CCl4)所致肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法選擇昆明種小鼠40只，隨機(jī)均分為百賽諾組、龍葵多糖低劑量組、龍葵多糖高劑量組、對照組、模型組。百賽諾組、龍葵多糖低劑量組、龍葵多糖高劑量組分別予百賽諾200 mg/kg、龍葵多糖200 mg/kg、龍葵多糖400 mg/kg灌胃，對照組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，均連續(xù)灌胃14天。末次灌胃1 h，對照組腹腔注射豆油溶液，其余四組腹腔注射含2% CCl4的豆油溶液。禁食12 h，龍葵多糖低劑量組、龍葵多糖高劑量組分別予龍葵多糖200、400 mg/kg灌胃，百賽諾組予百賽諾200 mg/kg灌胃，對照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。灌胃30 min，摘除眼球取血，檢測血清AST、ALT；斷頸處死小鼠，取肝臟，檢測肝臟指數(shù)及肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。結(jié)果與對照組比較，模型組肝臟指數(shù)增加(P<0.01)；龍葵多糖高劑量組及百賽諾組肝臟指數(shù)均較模型組降低(P均<0.05)。與對照組比較，模型組血清AST、ALT水平均升高，肝組織勻漿SOD水平降低、MDA水平升高(P均<0.05)；與模型組比較，龍葵多糖低、高劑量組及百賽諾組血清AST、ALT水平均降低，肝組織勻漿SOD水平均升高，MDA水平均降低(P均<0.05)。結(jié)論龍葵多糖對CCl4所致的肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增加肝組織抗氧化能力有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肝損傷；龍葵多糖；四氯化碳；抗氧化作用；小鼠

龍葵全草及果實(shí)含有紅色素、氨基酸、維生素、多糖類、生物堿類等多種物質(zhì)[1~3]，具有清熱消腫、消炎止咳、抗腫瘤等作用[4]，目前已應(yīng)用于食品、染料、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5]。研究表明，龍葵多糖主要通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，是一種免疫增強(qiáng)劑，通過提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化而發(fā)揮保護(hù)生物膜的作用[6]。但龍葵多糖是否具有肝保護(hù)作用，國內(nèi)外鮮見報(bào)道。2015年3~6月，本研究觀察了龍葵多糖對四氯化碳(CCl4)致小鼠肝損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料健康雄性昆明種小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。顆粒飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食、飲水。龍葵多糖[制備：取干燥的龍葵全草，加入4倍體積水，微沸浸提5 h，過濾，濾渣重復(fù)提取3次，合并3次的水提液。靜置去沉淀后濃縮，逐漸加入95%乙醇(1∶4)并不斷攪拌，4 ℃靜置24 h。抽濾沉淀，分別用無水乙醇、丙酮、石油醚淋洗3次，得到淺黃色粉末狀物質(zhì)，干燥。將其溶于水中，加入等體積Savage液(氯仿∶正丁醇=4∶1)，振蕩、混勻、離心，棄下層有機(jī)相，重復(fù)上述操作10次，將游離蛋白除盡，保留上清液，干燥后稱質(zhì)量。500 g龍葵全草經(jīng)過上述操作后得到龍葵粗多糖47.1 g(9.42%)]。AST、ALT試劑盒和MDA、SOD試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2動(dòng)物分組及處理所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為百賽諾組、龍葵多糖低劑量組、龍葵多糖高劑量組、對照組、模型組，每組8只。前三組分別予百賽諾200 mg/kg、龍葵多糖200 mg/kg、龍葵多糖400 mg/kg灌胃，后兩組予等體積生理鹽水灌胃，灌胃體積均為0.3 mL，均連續(xù)灌胃14天。末次灌胃1 h，對照組腹腔注射豆油溶液，其余四組腹腔注射含2% CCl4的豆油溶液，注射體積均為0.2 mL。禁食12 h，龍葵多糖低劑量組、龍葵多糖高劑量組分別予龍葵多糖200、400 mg/kg灌胃，百賽諾組予百賽諾200 mg/kg灌胃，對照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察①血清AST、ALT：灌胃30 min，摘除眼球取血，分離血清，采用AST、ALT試劑盒檢測血清AST、ALT。②肝臟指數(shù)：小鼠稱質(zhì)量后斷頸處死，取出肝臟稱質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×1 000[5]。③肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)：肝臟組織勻漿，離心獲上清，制備成10%組織勻漿液，采用MDA、SOD試劑盒檢測MDA、SOD。

2結(jié)果

2.1各組血清ALT、AST水平比較見表1。

表1　各組血清ALT、AST水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與百賽諾組比較，△P<0.05。

2.2各組肝臟指數(shù)比較見表2。

表2　各組肝臟指數(shù)比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

2.3各組肝組織勻漿SOD、MDA比較見表3。

表3　各組肝組織勻漿SOD、MDA水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3討論

龍葵全草均可入藥，具有抗腫瘤、抑菌、抗病毒作用，對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病具有較好療效[7～10]。龍葵經(jīng)水提醇沉法可獲得水溶性多糖，即龍葵多糖。研究表明，龍葵多糖具有良好的抑瘤效果和免疫調(diào)節(jié)功能[11]，但其對肝損傷是否具有保護(hù)作用鮮見報(bào)道。

CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型是急性肝損傷研究的典型模型。目前認(rèn)為，CCl4引起肝細(xì)胞中毒與其自由基代謝產(chǎn)物導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過氧化有關(guān)，其機(jī)制是CCl4經(jīng)肝細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素P450氧化酶系統(tǒng)代謝、激活后生成三氯甲烷自由基、二氯甲烷自由基及過氧化三氯甲烷自由基，攻擊肝細(xì)胞膜或激活膜上的磷酸化酶，引起細(xì)胞膜和細(xì)胞器質(zhì)膜過氧化損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成發(fā)生障礙。CCl4誘發(fā)急性肝損傷的病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞彌漫性變性、壞死、大量炎性細(xì)胞浸潤，與臨床病毒性肝炎病理變化極為相似。百賽諾(雙環(huán)醇片)可保護(hù)肝細(xì)胞膜和線粒體，減輕肝臟的炎性損傷，防止肝纖維化；可增強(qiáng)肝臟蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，可作為肝損傷陽性對照藥物。

ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞的胞質(zhì)和線粒體中，血清含量很低。血清ALT、AST水平可反映肝細(xì)胞膜損傷程度，是評價(jià)肝細(xì)胞壞死的重要指標(biāo)[12]。肝臟指數(shù)是反映肝細(xì)胞炎性病變的重要指標(biāo)，其水平與肝臟損傷程度呈正相關(guān)。肝損傷后細(xì)胞膜通透性增加，ALT、AST逸出細(xì)胞，導(dǎo)致血清ALT、AST升高。本研究結(jié)果顯示，模型組肝臟指數(shù)及血清AST、ALT水平均較對照組顯著升高。說明小鼠急性肝損傷模型制備成功。

正常生理狀態(tài)生物體內(nèi)不斷生成自由基，機(jī)體可以通過自身的抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行清除，不至于引起組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化而出現(xiàn)肝損傷。SOD是體內(nèi)代謝活性氧游離基的主要酶，其功能是將細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生的活性氧游離基代謝為過氧化氫，生成的過氧化氫在過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化酶的催化下分解為水，以消除自由基，阻止自由基的脂質(zhì)過氧化。CCl4誘發(fā)肝細(xì)胞產(chǎn)生的大量自由基可引起脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物(LPO)，LPO進(jìn)一步氧化成終產(chǎn)物MDA。MDA含量可反映組織脂質(zhì)過氧化程度。本研究結(jié)果表明，龍葵多糖低、高劑量組肝臟指數(shù)及血清ALT、AST水平均較模型組降低，說明龍葵多糖對急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，且效果與臨床常用保肝藥物百賽諾相近。龍葵多糖可以顯著增加肝損傷小鼠肝組織SOD活性，降低MDA水平，提示龍葵多糖可能通過增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗氧化能力，維持細(xì)胞質(zhì)膜正常結(jié)構(gòu)，減輕肝組織損傷程度。

綜上所述，龍葵多糖對CCl4所致的急性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增加肝組織抗氧化能力有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馬桂芳,底秀娟,申振元,等.2002年河南省綜合疾病監(jiān)測結(jié)果分析[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2004,15(1):32-33.

[2] 莫海洪,曾和平,肖桂武.龍葵水溶性成分的初步研究[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1995，27(2):41-45.

[3] 李淼,范玉玲,王彥波.龍葵有效成分提取工藝及藥理作用的研究概況[J].黑龍江醫(yī)藥,2006,19(1):24-26.

[4] 許龍波,高世勇,季宇彬.龍葵多糖對S180荷瘤小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響[J].中草藥,2009,40(S1):211-212

[5] Ramesh H, Yamaki K, Tsusida T. Effect of fenu greek(Trigonela foenum graecum L.)galactomannan fractions on phagocytosis in rat macrophages and on proliferation and IgM secretion in HB4C5 cells[J]. Carbohydr Polym, 2002,50(1):79-83.

[6] 呂翠霞,李秀榮.清熱解毒中藥治療中晚期原發(fā)性肝癌的臨床與實(shí)驗(yàn)研究概況[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),1999,23(3):224-227.

[7] Zaidi SK, Hoda MN， Tabrez S, et al. Protective effect of solanum nigrum leaves extract on immobilization stress induced changes in rat＇s brain[J]． Evid Based Complement Alternat Med, 2014,2014:912450.

[8] 胡兵,安紅梅,沈克平,等.龍葵對人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞粘附、移動(dòng)和侵襲的影響[J].中藥材,2013,36(6):958-961.

[9] Chen H, Qi X. Study on the effect of polysaccharides from solanum nigrum Linne on cellular immune function in tumour-bearing mice[J]. Afr J Tradit Complement Altern Med, 2013,10(4):41-46．

[10] 李秀霞.龍葵的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1998,21(1):23-25.

[11] 李健,韓增勝,李青旺.龍葵多糖抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(3):14589-14590.

[12] 郭菁菁,楊秀芬.黃酮類化合物對動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性肝損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2008,24(1):5-10.

(收稿日期：2015-07-10)

中圖分類號：R575.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)08-0023-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.08.008

通信作者：王益民(E-mail: drwangyimin@126.com)

基金項(xiàng)目：河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(14397702D)。