下調(diào)HEATR3表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖及Akt信號(hào)通路的影響

王倩，鮑永華,陳志國(guó)，楊萬(wàn)才

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

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下調(diào)HEATR3表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖及Akt信號(hào)通路的影響

王倩，鮑永華,陳志國(guó)，楊萬(wàn)才

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

摘要：目的觀察下調(diào)HEATR3表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖以及Akt信號(hào)通路的影響，探討HEATR3在結(jié)直腸癌中的作用。方法將HCT116細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染HEATR3的干擾RNA及無(wú)義序列；采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的光密度(OD)值，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HEATR3 mRNA，Western blot法檢測(cè)HEATR3、Akt、p-Akt。結(jié)果兩組轉(zhuǎn)染前細(xì)胞增殖無(wú)差異，與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，觀察組轉(zhuǎn)染后24、36、48 h時(shí)細(xì)胞增殖的OD值均降低(P均<0.05)；轉(zhuǎn)染48 h，觀察組HEATR3 mRNA及蛋白表達(dá)量分別為0.49±0.04、0.03±0.01，對(duì)照組分別為2.08±0.45、0.47±0.01，P均<0.05。觀察組Akt、p-Akt蛋白表達(dá)量分別為0.49±0.01、0.05±0.01，對(duì)照組分別為0.96±0.01、0.92±0.01，P均<0.05；結(jié)論下調(diào)HEATR3表達(dá)可通過(guò)抑制Akt信號(hào)通路降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力，HEATR3可能是結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的一個(gè)重要癌基因。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸癌；HEATR3基因；細(xì)胞增殖；蛋白激酶B

結(jié)直腸癌(CRC)在美國(guó)居惡性腫瘤第3位，在腫瘤病死率中居第2位[1]。在中國(guó)，CRC在惡性腫瘤發(fā)病率中排第4位，并有上升的趨勢(shì)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，CRC的發(fā)生、發(fā)展與抑癌基因的失活或表達(dá)下調(diào)以及癌基因的激活或表達(dá)上調(diào)相關(guān)，它們的改變會(huì)導(dǎo)致腫瘤信號(hào)通路的激活，如Wnt/β-catenin[3～5]、炎癥信號(hào)通路[6, 7]、Akt信號(hào)通路[8～10]等。HEATR3是近兩年通過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn)的基因，目前對(duì)其了解甚少，只發(fā)現(xiàn)HEATR3與德系猶太人的克羅恩病發(fā)生相關(guān)[11]。2014年6～12月，我們針對(duì)HEATR3設(shè)計(jì)了高效的干擾RNA(siRNA)，觀察其對(duì)CRC細(xì)胞增殖以及Akt信號(hào)通路的影響，探討其在CRC中的作用。

1材料與方法

1.1材料人CRC細(xì)胞系HCT116購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所；HEATR3的siRNA及其無(wú)義序列(對(duì)照NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Corning公司)，胰酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，胎牛血清(Thermo Fisher Scientific公司)；Western及IP細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；DMSO、MTT、逆轉(zhuǎn)錄試劑5X All-in-One RT Mastermix(ABM 公司)，TRIzol 試劑(Invitrogen公司)，EvaGreen qPCR Mastermix ROX(ABM公司)；Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，ECL試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Akt抗體(Proteintech公司)，p-Akt、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology公司)，HEATR3抗體(Proteintech公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度95%。細(xì)胞傳代后用胰酶消化，接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿和96孔板中；將細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，分別利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染HEATR3-siRNA和對(duì)照NC，按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.2HEATR3 mRNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。轉(zhuǎn)染48 h，收集兩組細(xì)胞。以TRIzol試劑提取RNA，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，-80 ℃保存。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒5X All-in-One RT Mastermix對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA-80 ℃保存。通過(guò)primer3.0在線軟件設(shè)計(jì)引物：HEATR3上游引物5′-CTCCTCTCTCGGTGGTCTGT-3′，下游引物5′-CTCGGGTGCTGGAGCTTTTC-3′，片段長(zhǎng)度191 bp；β-actin上游引物5′-CGCCAAGCACGATGAAGA-3′，下游引物5′-CTGTTGGAAGGTGGAAAGAGATG-3′，片段長(zhǎng)度149 bp，引物由上海生工公司合成。利用EvaGreen qPCR Mastermix ROX熒光定量PCR試劑盒在StepOnePlus Real-Time PCR System上進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，PCR體系及反應(yīng)條件按照試劑盒說(shuō)明書操作。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，取平均Ct值，以2-ΔΔCt值表示mRNA表達(dá)水平。

1.2.3細(xì)胞增殖觀察采用MTT法。分別于轉(zhuǎn)染前(0 h)及轉(zhuǎn)染后24、36、48 h，向96孔板的細(xì)胞中加入MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后除去細(xì)胞培養(yǎng)基；每孔加入100 μL DMSO溶液，輕輕振蕩10 min；待紫色結(jié)晶完全溶解后，置于多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)中，檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下的光密度(OD)值，以此表示細(xì)胞增殖情況。

1.2.4HEATR3、Akt、p-Akt檢測(cè)采用Western blot法。收集60 mm培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，加入Western及IP細(xì)胞裂解液提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。加入上樣緩沖液后煮蛋白5 min，采用Western blot法檢測(cè)HEATR3、Akt、p-Akt、GAPDH，應(yīng)用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)和ECL溶液拍照并保存。通過(guò)Image J軟件分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示蛋白表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1兩組HEATR3 mRNA及蛋白比較轉(zhuǎn)染48 h，觀察組HEATR3 mRNA及蛋白表達(dá)量分別為0.49±0.04、0.03±0.01，對(duì)照組分別為2.08±0.45、0.47±0.01，P均<0.05。

2.2兩組細(xì)胞增殖情況比較見(jiàn)表1。

表1　兩組細(xì)胞增殖情況比較±s)

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05。

2.3兩組Akt、p-Akt蛋白表達(dá)比較轉(zhuǎn)染48 h，觀察組Akt、p-Akt蛋白表達(dá)量分別為0.49±0.01、0.05±0.01，對(duì)照組分別為0.96±0.01、0.92±0.01，P均<0.05。

3討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Akt信號(hào)通路可通過(guò)其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，并且對(duì)端粒酶活性、腫瘤血管的生成以及腫瘤的侵襲有促進(jìn)作用。因此，Akt信號(hào)通路在腫瘤的研究具有十分重要的意義。Akt可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的直接作用傳遞生存信號(hào)。通過(guò)使用PI3K抑制劑可以抑制CRC細(xì)胞系Colo205內(nèi)Cyclin D的表達(dá)；而p-Akt可以逆轉(zhuǎn)PI3K抑制劑對(duì)Cyclin D的抑制作用，而且這種逆轉(zhuǎn)作用不能被PI3K抑制劑所拮抗；說(shuō)明Akt可以促進(jìn)Cyclin D的表達(dá)[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)，Mdm2是Akt通路下游的一個(gè)作用底物，它可以特異性地被Akt磷酸化，從而使胞質(zhì)中的Akt-Mdm2復(fù)合物迅速解離、Mdm2進(jìn)入細(xì)胞核并與p53結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)p53降解并抑制其功能；而p53 則可以通過(guò)多種途徑影響細(xì)胞周期的進(jìn)行[12]。另外，研究發(fā)現(xiàn)Akt與腫瘤永生化因子端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基hTERT有關(guān)[13]。在黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-MEL28中發(fā)現(xiàn)，hTERT可能作為Akt的作用底物而被激活[14]。

HEATR3作為一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白，其作用機(jī)制尚不清楚。目前，研究發(fā)現(xiàn)HEATR3與德系猶太人的克羅恩病發(fā)生相關(guān)，其通過(guò)激活NOD2信號(hào)通路從而對(duì)德系猶太人的克羅恩病發(fā)生起著促進(jìn)作用[15]。而克羅恩病與CRC的發(fā)生密切相關(guān)，由此可以部分地支持本研究中HEATR3作為一種癌基因的觀點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中下調(diào)HEATR3表達(dá)能夠明顯抑制Akt以及p-Akt的表達(dá)，從而通過(guò)Akt信號(hào)通路對(duì)CRC細(xì)胞的增殖起著重要的調(diào)節(jié)作用。今后我們將進(jìn)一步研究HEATR3對(duì)于其他CRC細(xì)胞系的影響，并探討HEATR3影響CRC發(fā)生、發(fā)展的其他作用機(jī)制。

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Effects of down-regulating HEATR3 on proliferation of colorectal cancer cells HCT116 and Akt signaling pathway

WANGQian,BAOYonghua,CHENZhiguo,YANGWancai

(XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)

Abstract:Objective To observe the effects of down-regulating HEATR3 on cell proliferation and Akt signaling pathway in colorectal cancer cell line HCT116, and to determine the role of HEATR3 in the colorectal cancer. MethodsHCT116 cells were randomly divided into the observation group and control group which were separately transfected with the siRNA of HEATR3 and nonsense sequence. The optical density (OD) value of cell proliferation was detected by MTT assay, the expression level of HEATR3 mRNA was detected by real-time fluorescent quantificative PCR, and the protein levels of HEATR3, Akt and p-Akt were detected by Western blotting. ResultsThere was no difference in the cell proliferation between the two group before transfection. The OD values of cell proliferation in the observation group were lower than those of the control group at 24 h, 36 h and 48 h after transfection (all P<0.05); the HEATR3 mRNA and protein levels in the observation group were 0.49±0.04, 0.03±0.01, and those were 2.08±0.45 and 0.47±0.01 in the control group at 48 h after transfection (all P<0.05). Akt and p-Akt protein levels in the observation group were 0.49±0.01 and 0.05±0.01, and those were 0.96±0.01 and 0.92±0.01 in the control group after transfection (all P<0.05). ConclusionThe down-regulation of HEATR3 can decrease the cell proliferation of colorectal cancer cells through inhibiting Akt signaling pathway, and HEATR3 may act as an important oncogene in the occurrence and development of colorectal cancer.

Key words:colorectal carcinoma; HEATR3 gene; cell proliferation; protein kinase B

(收稿日期：2015-12-01)

通信作者簡(jiǎn)介：鮑永華(1976-)，女，教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤免疫。E-mail： baoyonghua2005@126.com

中圖分類號(hào)：R735.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)10-0004-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.002

作者簡(jiǎn)介：第一王倩(1988-)，女，在讀碩士，主要研究方向?yàn)槟[瘤免疫。E-mail： wangqian88718@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃項(xiàng)目(91229115)；河南省腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(13IRTSTHN013)；

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新支持計(jì)劃項(xiàng)目(YJSCX20408Z)。