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    重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在CHO/dhfr-細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)和純化

    2016-04-12 11:50:44劉春鳳王世媛陳清西
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株克隆質(zhì)粒

    劉春鳳,張 寧,周 婷,王世媛,陳清西*

    ( 1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建廈門361005; 2.廈門特寶生物工程股份有限公司,福建廈門361022)

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    重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在CHO/dhfr-細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)和純化

    劉春鳳1,張寧2,周婷2,王世媛2,陳清西1*

    ( 1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建廈門361005; 2.廈門特寶生物工程股份有限公司,福建廈門361022)

    摘要:構(gòu)建了含重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1( rhTGF-β1)基因的真核表達(dá)載體,并利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法,將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到二氫葉酸還原酶( DHFR)缺陷型哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO/dhfr(-)中,通過氨甲喋呤( MTX)加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的細(xì)胞株.于14 L細(xì)胞發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)( ELISA)檢測(cè)得表達(dá)量在3 mg/L左右.采用親和層析、反相層析及分子篩凝膠層析的方法分離純化,獲得的rhTGF-β1試制品的純度大于97%,得率在25%以上.通過基質(zhì)輔助激光解析電離化飛行時(shí)間質(zhì)譜( MALDI-TOF MS)測(cè)定rhTGF-β1的分子量為25.470 ku,與理論分子量一致.N端蛋白序列分析儀分析其N端氨基酸序列,與理論的氨基酸序列一致.rhTGF-β1具有抑制水貂肺上皮細(xì)胞Mv-1-Lu增殖的活性,測(cè)定其比活為3.2×107IU/mg,與商品化的rhTGF-β1標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng).本研究為進(jìn)一步規(guī)模化制備rhTGF-β1奠定了基礎(chǔ).

    關(guān)鍵詞:重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;表達(dá);純化

    轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β( transforming growth factor-β,TGF-β)是一類具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育和凋亡等多種生命活動(dòng)[1].TGF-β亞家族目前報(bào)道有6種,分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5和TGF-β6,它們氨基酸序列之間有70%~80%的同源性[2].哺乳動(dòng)物僅有3種,分別為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,其中TGF-β1在體細(xì)胞系中所占比例最高(>90%),活性最強(qiáng).在人體的多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明,TGF-β1能夠有效抑制多類細(xì)胞的增殖,參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)以及細(xì)胞間質(zhì)的形成等各種生理過程[3].

    在大多數(shù)細(xì)胞中,未成熟的TGF-β1由390個(gè)氨基酸組成,在胞內(nèi)蛋白內(nèi)切酶的作用下,N端278個(gè)氨基酸形成前導(dǎo)肽或潛伏結(jié)合多肽( latency-associated peptide,LAP),C端112個(gè)氨基酸為成熟肽.前導(dǎo)肽通過2個(gè)半胱氨酸殘基( Cys)鏈間二硫鍵形成二聚體;成熟肽具有9個(gè)高度保守的Cys,其中8個(gè)Cys相互靠近,形成鏈內(nèi)二硫鍵,第9個(gè)Cys形成鏈間二硫鍵,構(gòu)成具有生物學(xué)活性的二聚體;前導(dǎo)肽與成熟肽被切開后仍以非共價(jià)的形式結(jié)合,形成一種與受體不能結(jié)合的潛在復(fù)合物,需通過改變離子強(qiáng)度和pH進(jìn)行分離,分離后的成熟肽才具有活性[4].

    目前已有的TGF-β1表達(dá)系統(tǒng)不夠完善,后續(xù)純化也比較復(fù)雜,故我們?cè)跇?gòu)建TGF-β1表達(dá)載體時(shí),在目的蛋白N端引入鼠血清白蛋白分泌信號(hào)肽和His6標(biāo)簽,以利于TGF-β1的蛋白分泌及后續(xù)純化.同時(shí),將TGF-β1前導(dǎo)肽中的Cys33突變?yōu)榻z氨酸殘基( Ser)以避免影響目的蛋白活性亞基解離,終產(chǎn)品序列與天然蛋白完全一致.pOptiVec-Topo載體(購于Invitrogen公司)通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入點(diǎn)( internal ribosome entry site,IRES)序列將目的基因和二氫葉酸還原酶( DHFR)基因連接形成雙順反子表達(dá)載體,IRES能夠不依賴5'帽子結(jié)構(gòu)而獨(dú)立起始翻譯,在轉(zhuǎn)錄時(shí)目的基因和DHFR基因形成同一條mRNA,以共同的效率和比例表達(dá),排除只整合了DHFR基因的假陽性克隆;應(yīng)用pOptiVec載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)有利于陽性克隆篩選,有氨甲喋呤( MTX)抗性的細(xì)胞均為陽性細(xì)胞株[5].

    本研究利用基因工程技術(shù),將來源Invitrogen公司的pOptiVec-Topo真核表達(dá)載體通過T4連接酶形成閉環(huán)的自連載體,然后將TGF-β1基因插入到改造后的pOptiVec真核表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)染DHFR缺陷型哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO/dhfr-,通過MTX梯度加壓篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)TGF-β1的細(xì)胞株,在TGF-β1表達(dá)產(chǎn)物的分離純化等技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行工藝研究,并對(duì)終產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行了相關(guān)鑒定,意在為今后規(guī)模化生產(chǎn)TGF-β1奠定基礎(chǔ).

    1材料和方法

    1. 1材料

    CHO/dhfr-細(xì)胞為ATCC公司產(chǎn)品;大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存; T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ和瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品; KODPlus Neo PCR酶為TOYOBO公司產(chǎn)品; lipofectamineTM2000、Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基購于Invitrogen公司;次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷( hypoxanthine、thymidine,HT)和MTX為Sigma公司產(chǎn)品;杜爾伯科改良依格爾培養(yǎng)基( DMEM)、胰酶和磷酸鹽緩沖液( PBS)為Hyclone公司產(chǎn)品;人TGF-β1鉑酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)( ELISA)試劑盒購買于eBioscience公司;丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品;螯合瓊脂糖凝膠FF、SOURCE 15S和葡聚糖凝膠G-25粗填料為General Electric( GE)公司產(chǎn)品;重組人TGF-β1( rhTGF-β1)標(biāo)準(zhǔn)品為R&D公司產(chǎn)品,其余均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

    主要儀器: NBS型14 L細(xì)胞發(fā)酵罐,B.Braun Biotech公司; 311型CO2培養(yǎng)箱,Thermo公司;全溫振蕩器,型號(hào)HZQ-F,哈爾濱東明醫(yī)療器械廠;離心機(jī),型號(hào)Avanti J-E,Beckman公司; P2B005A01超濾膜,Millipore公司;蛋白純化儀,型號(hào)Basic 100,GE公司;基質(zhì)輔助激光解析電離化飛行時(shí)間質(zhì)譜( MALDI-TOF MS),型號(hào)REFLEXTMⅢ,Bruker公司; N端蛋白序列分析儀,島津公司; SpectraMan M2e酶標(biāo)儀,Molecular Devices( MD)公司.

    1. 2 rhTGF-β1真核表達(dá)載體的構(gòu)建

    根據(jù)人TGF-β1的氨基酸序列( NM_000660),采用真核細(xì)胞喜好密碼子,按照三聯(lián)體密碼原則編排出TGF-β1 cDNA序列.交由捷瑞基因公司合成TGF-β1全基因,插入pGH質(zhì)粒中.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒,于37℃分別對(duì)TGF-β1基因擴(kuò)增產(chǎn)物和改造后真核表達(dá)載體pOptiVec進(jìn)行BamHⅠ、NotⅠ雙酶切,純化回收酶切產(chǎn)物,并在T4連接酶作用下4℃過夜使表達(dá)載體與目的片段連接,連接產(chǎn)物取10 μL轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于LB/Amp抗性平板,37℃培養(yǎng)過夜.挑取單菌落接種于5 mL LB/Amp抗性液體培養(yǎng)基,37℃,220 r/min培養(yǎng)過夜.使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,BamHⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定,經(jīng)雙酶切初步篩選的陽性克隆進(jìn)行核酸測(cè)序,測(cè)序驗(yàn)證無誤的質(zhì)粒用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染.

    1. 3重組質(zhì)粒DNA的大量制備及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞株

    將包含驗(yàn)證無誤的質(zhì)粒pOptiVec/TGF-β1的DH5α菌株接種到一定量的LB/Amp抗性液體培養(yǎng)基中,37℃220 r/min培養(yǎng)過夜.次日,采用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒制備得到質(zhì)粒pOptiVec/TGF-β1,紫外分光光度儀測(cè)定所得質(zhì)粒的濃度和純度.獲得的重組質(zhì)粒用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO/dhfr-細(xì)胞株.轉(zhuǎn)染前24 h,將CHO/dhfr-細(xì)胞以2×106接種6孔板,轉(zhuǎn)染當(dāng)天確認(rèn)細(xì)胞匯合度介于90%~95%.轉(zhuǎn)染試劑采用陽離子脂質(zhì)體lipofectamineTM2000,按照質(zhì)粒:轉(zhuǎn)染試劑=1∶3的比例取質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑先分別與Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基混合,體積各100 μL.然后將兩者混合,室溫放置15 min,添加800 μL Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基輕輕混勻,加入到細(xì)胞中,培養(yǎng)4 h后即可更換完全培養(yǎng)基( DMEM+ 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胎牛血清白蛋白( FBS) +HT+10-6MTX培養(yǎng)基).

    1. 4穩(wěn)定表達(dá)rhTGF-β1細(xì)胞株的篩選

    轉(zhuǎn)染24 h后分板,按照每孔100個(gè)細(xì)胞鋪96孔板20塊,MTX初始加壓濃度為100 nmol/L,后每輪濃度提高一定倍數(shù).每步加壓前均先亞克隆化,ELISA選擇高表達(dá)亞克隆株進(jìn)行下一步加壓.加壓過程中細(xì)胞采用6孔板或T25方瓶培養(yǎng),加壓時(shí)細(xì)胞按匯合度為20%~30%鋪板,細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代2~5次,待細(xì)胞適應(yīng)該篩選壓力、無細(xì)胞凋亡且增殖速度正常視為一輪加壓完成,一般需2周左右.通過計(jì)算pg/cell/day( PCD)評(píng)價(jià)加壓前后rhTGF-β1表達(dá)是否提高.加壓前和加壓后細(xì)胞均按1×105mL-1,2 mL接種于6孔板,培養(yǎng)2 d后取上清,采用ELISA檢測(cè)rhTGF-β1表達(dá)量,計(jì)算rhTGF-β1的PCD值.PCD有提高的細(xì)胞株保種并繼續(xù)下一輪MTX加壓,共進(jìn)行3輪.

    1. 5 rhTGF-β1的純化

    轉(zhuǎn)染有rhTGF-β1表達(dá)質(zhì)粒的CHO/dhfr-細(xì)胞株使用14 L細(xì)胞固定床發(fā)酵罐發(fā)酵表達(dá)rhTGF-β1,采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),收集培養(yǎng)液上清,離心收集發(fā)酵上清.

    1. 5. 1膜包超濾

    取離心發(fā)酵上清,6 ku膜包超濾濃縮,400 mL超純水置換4次,再用含50 mmol/L NaCl、50 mmol/L精氨酸、50 mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)的緩沖液置換4次,收集超濾樣品.

    1. 5. 2 Ni柱捕獲

    選擇螯合瓊脂糖凝膠FF填料,將超濾后樣品3∶1加入含100 mmol/L咪唑、50 mmol/L NaCl、50 mmol/L精氨酸、50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)的洗脫緩沖液混勻上樣,再用300 mmol/L咪唑、50 mmol/L NaCl、50 mmol/L精氨酸、50 mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)洗脫,收集目的樣品.

    1. 5. 3 G25柱脫鹽

    選擇葡聚糖凝膠G-25粗填料,將Ni柱洗脫樣品上樣,用含1 mol/L NaCl,100 mmol/L甘氨酸( pH 4.0)的緩沖液置換,收集目的樣品,以稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3.0,4℃保存過夜.

    1. 5. 4反向柱純化

    選擇SOURCE 15S填料,將G-25柱洗脫樣品上樣,以30%洗脫緩沖液平衡后,50%洗脫緩沖液洗脫,收集目的樣品.上樣緩沖液為100 mmol/L NaCl、2%乙腈,洗脫緩沖液為0.3%乙酸、70%乙腈.

    1. 5. 5 G-25柱脫鹽

    選擇葡聚糖凝膠G-25粗填料,將反相柱洗脫樣品上樣,用含150 mmol/L NaCl、100 mmol/L甘氨酸( pH 4.0)的緩沖液置換,收集目的樣品,凍存于-70℃.

    1. 6 rhTGF-β1的鑒定

    1. 6. 1質(zhì)譜法測(cè)定分子質(zhì)量

    采用MALDI-TOF MS測(cè)定rhTGF-β1分子質(zhì)量,基質(zhì)為α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-h(huán)ydroxy-cinnamic acid,HCCA,C10H7NO3,相對(duì)分子質(zhì)量為189.17).

    1. 6. 2氨基酸序列分析

    采用Edman降解法測(cè)定rhTGF-β1的N端15個(gè)氨基酸序列,N端蛋白序列分析儀自動(dòng)顯示測(cè)序峰.

    1. 6. 3生物學(xué)活性檢測(cè)

    將收集的培養(yǎng)液上清通過1.5小節(jié)所述的純化手段獲得高純度的rhTGF-β1樣品,水貂肺上皮細(xì)胞以2 ×105/mL鋪板,體積100 μL,細(xì)胞稀釋培養(yǎng)基與樣品稀釋培養(yǎng)基均為DMEM+1%FBS,rhTGF-β1標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均以50 ng/mL上板,2.5倍梯度稀釋,共10個(gè)梯度.樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)48 h,加入3-( 4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽( MTT)溶液20 μL,37℃放置4 h,加入150 μL細(xì)胞裂解液吹打混合均勻,于酶標(biāo)儀讀取570 nm和630 nm吸光值.根據(jù)樣品生物學(xué)活性=E×( C1/C)×( D1/D) (其中,E為標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)( IU/ mL),D1為樣品預(yù)稀釋倍數(shù),D為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù),C1為樣品半效稀釋度,C為標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋度),計(jì)算rhTGF-β1的生物學(xué)活性.

    2結(jié)果

    2. 1重組質(zhì)粒pOptiVec/TGF-β1的構(gòu)建和鑒定

    將pGH-TGF-β1質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)和改造型pOptiVec載體分別用BamHⅠ、NotⅠ進(jìn)行雙酶切,回收連接,獲得重組質(zhì)粒pOptiVec/TGF-β1,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取3個(gè)單克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)后通過BamHⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定,經(jīng)鑒定均為陽性克隆(圖2),證明TGF-β1片段已經(jīng)成功插入到pOptiVec載體中.取2號(hào)質(zhì)粒測(cè)序,結(jié)果與預(yù)期相符.

    圖2陽性克隆酶切鑒定電泳圖譜Fig.2 Positive colony verification by restriction enzyme digestion

    2. 2 rhTGF-β1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的獲得

    初期篩選均采用不含HT的DMEM+10%FBS培養(yǎng)基,37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2周左右開始,在顯微鏡下觀察可以陸續(xù)看到明顯的細(xì)胞克隆形成;同時(shí),未轉(zhuǎn)染rhTGF-β1表達(dá)質(zhì)粒的CHO/dhfr-細(xì)胞由于缺乏次黃嘌呤( hypoxanthine)、胸腺嘧啶( thymidine)的外部供給已經(jīng)全部死亡.共進(jìn)行了3次MTX加壓篩選,梯度依次為100,1 000和2 000 nmol/L.最后獲得2株穩(wěn)定表達(dá)TGF-β1的細(xì)胞株.

    2. 3 rhTGF-β1的純化及終產(chǎn)品的純度

    依據(jù)目的蛋白得率、純度、工藝穩(wěn)健性等指標(biāo)確定rhTGF-β1純化工藝路線.rhTGF-β1發(fā)酵上清經(jīng)各步層析,目的峰均能與雜質(zhì)峰有效分離,通過4步純化,得率>25%.

    經(jīng)多步純化獲得的rhTGF-β1采用SDS-PAGE法測(cè)定樣品電泳純度.由于rhTGF-β1是同源二聚體,純化樣品分別用和不用二硫蘇糖醇( DTT)還原處理,上樣量5 μg( 100%),控制樣品分別上樣150 ng( 3%)、50 ng( 1%),電壓100~200 V,銀染,掃描分析電泳結(jié)果(圖3).電泳分析顯示,純化后樣品經(jīng)DTT還原處理分子質(zhì)量在14 ku左右(理論值為12.7 ku),應(yīng)為單體的rhTGF-β1;純化后樣品未經(jīng)DTT還原處理分子質(zhì)量在30 ku偏下(理論值為25 ku),應(yīng)為二聚體的rhTGF-β1.圖中150 ng( 3%)的蛋白條帶亮于目的樣品的雜質(zhì)帶,說明rhTGF-β1的雜質(zhì)含量<3%,即rhTGF-β1的電泳純度>97%.

    圖3 rhTGF-β1純化樣品SDS-PAGE檢測(cè)Fig.3 SDS-PAGE analysis of rhTGF-β1 purified sample

    2. 4 rhTGF-β1的分子質(zhì)量及N端氨基酸序列

    采用測(cè)定MALDI-TOF MS測(cè)定rhTGF-β1分子質(zhì)量為25.470 ku,與理論分子量一致,結(jié)果見圖4.

    圖4 rhTGF-β1純化樣品質(zhì)譜檢測(cè)Fig.4 Mass spectrum of rhTGF-β1 purified sample by MALDI-TOF MS

    經(jīng)N端氨基酸序列測(cè)定,rhTGF-β1樣品N端15個(gè)氨基酸殘基序列為ALDTNYXFSSTEKNX(因Cys不能直接觀察到,用X表示),測(cè)序結(jié)果與理論的TGF-β1蛋白N端氨基酸序列一致.

    2. 5 rhTGF-β1活性的檢測(cè)

    以R&D rhTGF-β1為標(biāo)準(zhǔn)品,采用MV-1-Lu細(xì)胞抑制法測(cè)定純化獲得的rhTGF-β1樣品,四參數(shù)回歸計(jì)算法處理檢測(cè)數(shù)據(jù),半數(shù)有效劑量( ED50)約為0.5 ng/mL,比活為3.2×107IU/mg,與R&D標(biāo)準(zhǔn)品活性相當(dāng)(圖5),說明通過CHO/dhfr-細(xì)胞表達(dá)的rhTGF-β1是有活性的.

    圖5 rhTGF-β1活性測(cè)定曲線Fig.5 Curve of rhTGF-β1 activity test

    3討論

    本研究中我們構(gòu)建了pOptiVec/TGF-β1重組質(zhì)粒.pOptiVec (改造)載體是采用T4連接酶將pOptiVec-Topo載體( Invitrogen公司)自連形成的.與常規(guī)使用的真核載體pSV2-dhfr載體比較,pSV2-dhfr載體目的基因和DHFR基因分別由不同的啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選的克隆有可能只整合了DHFR基因造成假陽性;應(yīng)用pOptiVec載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)有利于陽性克隆篩選,有MTX抗性的細(xì)胞均為陽性細(xì)胞株.

    另外,我們采用CHO/dhfr-細(xì)胞進(jìn)行rhTGF-β1的表達(dá),CHO/dhfr-細(xì)胞自身缺失DHFR[6],無法自身合成四氫葉酸,所以必須在添加了次黃嘌呤( hypoxanthine)、胸腺嘧啶( thymidine)和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活.通過目的基因與DHFR基因共轉(zhuǎn)染,不僅得到在不含上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆,更為重要的是由于DHFR可被葉酸類似物MTX所抑制,在MTX濃度選擇壓力下,DHFR基因必須擴(kuò)增到很多的拷貝數(shù)才能生存,從而得到抗MTX細(xì)胞系,又由于與DHFR基因共轉(zhuǎn)染的目的基因傾向于同它一起整合到細(xì)胞染色體上的同一區(qū)域,所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著DHFR基因的擴(kuò)增而擴(kuò)增,我們就得到了能大量表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞克隆,將rhTGF-β1的表達(dá)量由常規(guī)的μg/L級(jí)別提高到mg/L.此外,本研究采用的純化工藝[7]獲得的純化樣品了純度>97%,得率>25%,且經(jīng)質(zhì)譜、蛋白N端測(cè)序鑒定和活性檢測(cè),結(jié)果均符合TGF-β1質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).

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    Expression,Purification and Bioactivity Assay of Recombinant Human Transforming Growth Factor-β1 in CHO/dhfr-Cell

    LIU Chunfeng1,ZHANG Ning2,ZHOU Ting2,WANG Shiyuan2,CHEN Qingxi1

    ( 1.School of Life Science,Xiamen University,Xiamen 361005,China; 2.Xiamen Amoytop Biotechnique Company,Xiamen 361022,China)

    Abstract:By CHO/dhfr(-)efficient expression,recombinant human transforming growth factor-β1 was conducted in a 14 L cell fermentation tank,and the expression quantity reached 3 mg/L.The purity of rhTGF-β1 was more than 97% with column chromatography method,and the yield was above 25%.Additionally,MALDI-TOF MS and N-terminal protein sequence analyzer were used to analyze its molecular weight and N-terminal sequence,and the activity was determined using MV-1-Lu( NBL-7) cell growth inhibition assay.The results showed that rhTGF-β1 activity was more than 3.2×107IU/mg.This study realized the efficient expression of rhTGF-β1 in CHO/dhfr(-),and the purified rhTGF-β1 sample by our methods were conformed to the standard of "China pharmacopoeia",which provided the basis for industrialized production of rhTGF-β1.

    Key words:transforming growth factor-β1; expression; purification

    *通信作者:chenqx@ xmu.edu.cn

    基金項(xiàng)目:國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃( 863計(jì)劃) ( 2007AA021604)

    收稿日期:2015-01-09錄用日期: 2015-02-14

    doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2016.01.012

    中圖分類號(hào):Q 356.1

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):0438-0479( 2016) 01-0067-05

    引文格式:劉春鳳,張寧,周婷,等.重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在CHO/dhfr-細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)和純化[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,55( 1) : 67-71.

    Citation: LIU C F,ZHANG N,ZHOU T,et al.Expression,purification and bioactivity assay of recombinant human transforming growth factors-β1 in CHO/dhfr-cell[J].Journal of Xiamen University( Natural Science),2015,55( 1) : 67-71.( in Chinese)

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