便攜掃描式熒光儀的研發(fā)

趙忠龍，楊志偉，王　海，張　晶，閔小平，*，葛勝祥

( 1．廈門大學(xué)信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建廈門361005; 2．廈門大學(xué)國家傳染病疫苗與診斷試劑研究工程中心，福建廈門361102)

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便攜掃描式熒光儀的研發(fā)

趙忠龍1，楊志偉1，王海1，張晶2，閔小平1，2*，葛勝祥2

( 1．廈門大學(xué)信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建廈門361005; 2．廈門大學(xué)國家傳染病疫苗與診斷試劑研究工程中心，福建廈門361102)

摘要:為了能夠?qū)崿F(xiàn)對血液中特定抗原濃度的即時檢測( POCT)，研制了基于時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的便攜式熒光儀．熒光儀以波長為365 nm的紫外LED作為激發(fā)光源，經(jīng)光學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生線光斑進(jìn)行掃描以及激發(fā)熒光信號，最后對光電二極管收集的光信號數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑、求斜率處理．使用該儀器對我們研發(fā)的紙條進(jìn)行檢測，并分析其靈敏度，結(jié)果表明稀釋倍數(shù)和檢測線面積/控制線面積( AT/AC)之間乘冪關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)為0．994 3．儀器靈敏度、穩(wěn)定性好，同時成本很低．

關(guān)鍵詞:即時檢測;時間分辨熒光免疫分析;掃描式熒光儀

目前，體外診斷行業(yè)的一個突出特點是它的兩極化發(fā)展趨勢，一極是大型自動化醫(yī)學(xué)檢驗儀器，另一極是小型即時檢測( point－of－care－testing，POCT)儀器．其中，POCT儀器檢測過程方便、快速且高效，獲得了市場越來越高的認(rèn)可度，在臨床應(yīng)用中的影響不斷擴(kuò)大［1－3］．

POCT型側(cè)向流紙條檢測技術(shù)結(jié)合定量免疫檢測技術(shù)在醫(yī)療保健、疾病診斷與防治等方面一直發(fā)揮著巨大的作用［4－5］．類似的定量免疫檢測方法已有相關(guān)的報道．例如Li等［6］為量化上轉(zhuǎn)換發(fā)光( UCP)粒子并做出其圖像，研制出了二維光學(xué)掃描系統(tǒng)，并將此系統(tǒng)應(yīng)用于上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒標(biāo)記免疫檢測．在功率為1．2 W，發(fā)光波長為980 nm的光纖耦合激光二極管上覆蓋一個透明的微流控芯片就可以激發(fā)UCP粒子發(fā)光，這種激發(fā)光可用光電倍增器( PMT)檢測．使用此掃描儀，從X和Y兩個方向掃描二維紙條只需要8 min［7］．

本文介紹了一種以時間分辨熒光免疫分析為生物依據(jù)的掃描式熒光儀［8－10］．它采用光纖作收發(fā)光的通道，光學(xué)掃描采用線掃描的方式，避免了點掃描的局部性和不穩(wěn)定性．采用16位的AD轉(zhuǎn)換器將高靈敏度光電二極管捕捉到的光信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，并對收集到的數(shù)字信號進(jìn)行分析，建立相關(guān)的數(shù)學(xué)模型，為后面的定量分析做基礎(chǔ)．儀器相對其他設(shè)備而言，在保證檢測靈敏度的同時，成本低、穩(wěn)定性好．

1實現(xiàn)方法及原理

1. 1時間分辨熒光免疫分析

熒光免疫分析是熒光檢測技術(shù)和免疫學(xué)反應(yīng)相互結(jié)合起來的一種免疫分析方法．其基本實現(xiàn)方法如下:使用某種特異性抗體，在其上標(biāo)記熒光基團(tuán)使之成為特異性試劑，與對應(yīng)抗原結(jié)合形成復(fù)合物［11－12］．

使用時間分辨熒光免疫技術(shù)進(jìn)行檢測時，激發(fā)光激發(fā)標(biāo)記物后適當(dāng)延遲一段時間再對標(biāo)記物熒光進(jìn)行檢測，可以提升檢測靈敏性，降低本底熒光干擾，增強(qiáng)穩(wěn)定性和特異性．而且還具有線性范圍更寬，試劑壽命更長的優(yōu)點［13－14］．

1. 2熒光儀紙條檢測原理

熒光儀紙條檢測原理如圖1所示:在檢測紙條上面貼有一層硝酸纖維素膜，用于固定抗原抗體結(jié)構(gòu)．

紙條前端是質(zhì)控線( control)，質(zhì)控線由包被羊抗鼠抗體和單克隆抗體(含熒光微球)組成，包被羊抗鼠抗體可以自動識別單克隆抗體，并形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)．所以質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度基本固定，用于判斷紙條是否合格．

紙條后端是檢測線( test)，它由包被單克隆抗體和單克隆抗體組成，這兩者不會結(jié)合，但是分別都可以和抗原結(jié)合，從而形成一個包被單克隆抗體+抗原+單克隆抗體的夾心結(jié)構(gòu)，抗原越多，與之穩(wěn)定結(jié)合固定在硝酸纖維素膜上的熒光微球越多，從而可以判斷熒光強(qiáng)度．

圖1熒光紙條檢測原理Fig．1 Strip detection principle of fluorometer

掃描式熒光儀使用的紙條結(jié)構(gòu)如圖2所示．

圖2紙條結(jié)構(gòu)平面圖Fig．2 Structure of the test strip

2光學(xué)設(shè)計

光學(xué)模塊是掃描式熒光儀的核心模塊，它控制著儀器信號源，對光信號進(jìn)行傳播和接收，決定著儀器最終檢測結(jié)果［15］．所以在光學(xué)模塊設(shè)計過程中，需要提高激發(fā)光光源工作穩(wěn)定性，降低激發(fā)光傳輸衰減度．為此，選擇高靈敏度光電二極管( ODA－6WB－500M)和石英光纖，具體如圖3所示．

從圖3可知，發(fā)射光源1負(fù)責(zé)紫外光的產(chǎn)生，濾光片3用于過濾發(fā)射光源，光探測單元2負(fù)責(zé)接收熒光紙條7反射的熒光信號，濾光片4負(fù)責(zé)對所接收到的光信號進(jìn)行濾波處理．其中光纖(呈Y型)負(fù)責(zé)對光形狀轉(zhuǎn)換傳遞等，具體如圖4所示．

從圖4可知，左端通光2連接LED燈接口，用于傳播LED燈發(fā)射的紫外光．在最右端將柱形光轉(zhuǎn)成切面為條形的光(長度等于紙條上檢測線寬度)，由右端通光2照射到紙條上．

圖3光學(xué)模塊設(shè)計圖Fig．3 Design of the optical module

圖4光纖刨面圖Fig．4 Cross－section of the optical fiber

在紫外光的照射下，紙條上的熒光顆粒就會被激發(fā)出熒光，右端通光1將此熒光傳遞給左端通光1供光電二極管接收．

光電二極管將接收到的熒光經(jīng)過處理，傳遞給模數(shù)轉(zhuǎn)換芯片進(jìn)行下一步的處理．

3數(shù)據(jù)處理

3. 1讀值檢測原理

對紙條進(jìn)行一次掃描，可以檢測到兩個熒光波峰，記錄下兩個波形面積之比，然后利用濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)紙條進(jìn)行大批量生物實驗，建立如下數(shù)學(xué)關(guān)系:“檢測線面積/控制線面積( AT/AC)～檢測物試劑濃度”．最后利用建立起來的數(shù)學(xué)模型去判斷未知的檢測試劑濃度．

3．2算法過程

在數(shù)學(xué)中，針對連續(xù)的數(shù)學(xué)模型，我們使用求導(dǎo)并對導(dǎo)函數(shù)分析來獲得某曲線的波峰信息．

根據(jù)此思想，一次檢測完成，獲得模數(shù)轉(zhuǎn)換以后的1 200個熒光數(shù)據(jù)點( Data［1 200］)如圖5，做如下處理:

圖5原始數(shù)據(jù)示意圖Fig．5 Origin data

3. 2. 1平滑處理

對于得到的原始數(shù)據(jù)，會有鋸齒數(shù)據(jù)存在，對此我們要先進(jìn)行平滑處理:

3. 2. 2求斜率

過濾掉鋸齒數(shù)據(jù)之后，就可以求Smooth［1 200］的斜率．由于操作點是離散點，所以我們借用求導(dǎo)的原理(圖6) :

圖6求導(dǎo)原理Fig．6 Principle of derivation

其中: ( x1，y1)，( x2，y2)為相鄰的點，這里使用了一個長度為2的窗口進(jìn)行滑動．當(dāng)前點的斜率可表示為:

其中，i的取值范圍5～1 195．Slope［1 200］如圖7所示．

圖7斜率示意圖Fig．7 Slope data

3．2．3求面積

在求面積之前，首先要找到波峰的起始點．

在求起始點時，為了精確，對Slope數(shù)據(jù)進(jìn)行大量實驗確定滑動窗口為10，即從Data［i］到Data［i+9］共10個點的平均值作為當(dāng)前點的斜率．

起點:

要得到終點，就需要先找出開始下降的點．下降點:

終點:

其中，j的范圍為: 10～1 190．

最后一步求面積，假設(shè):基線值、波峰寬度、毛面積、凈面積依次如下:

通過以上分析，即可得到圖5中波峰的信息，具體如表1所示．

4性能分析

表1波峰檢測結(jié)果Tab．1 Result of peak recognition

為了測試熒光儀的靈敏度，用其來檢測血液中丙型肝炎病毒抗原( HCV)的濃度．

控制線( C線)為羊抗鼠多抗，檢測線( T線)為12F12抗體(起包被作用)，樣品墊中為W4G3抗體(含熒光顆粒，起標(biāo)記作用)．

在吸收墊的作用下，血液中的HCV抗原、12F12抗體、W4G3抗體在T線處結(jié)合均形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，W4G3和羊抗鼠多抗在C線處結(jié)合成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)．

使用標(biāo)準(zhǔn)紙條進(jìn)行測試，對已知固定濃度樣本按不同比例進(jìn)行稀釋，檢測得到AT/AC的值如表2所示．

表2 AT/AC與稀釋倍數(shù)Tab．2 AT/AC and dilution ratio

由AT/AC與稀釋倍數(shù)得到乘冪趨勢線如圖8所示．

由圖8可知，AT/AC和稀釋倍數(shù)之間乘冪趨勢線，相關(guān)系數(shù)R2= 0．994 3，說明在稀釋倍數(shù)足夠大的時候，儀器檢測出的值逐漸趨于一致，這與我們預(yù)計的一致，也進(jìn)一步說明該儀器靈敏度高．

5結(jié)論

本文主要介紹以時間分辨熒光免疫分析技術(shù)為生物檢測原理實現(xiàn)掃描式熒光儀的研發(fā)．掃描式熒光儀工作時，紫外LED燈發(fā)出的光經(jīng)過光學(xué)結(jié)構(gòu)后，以條形光束照射在熒光顆粒標(biāo)記的紙條上，模數(shù)轉(zhuǎn)換器將高靈敏度光電二極管檢測到的熒光信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，交由處理器，至此完成一個條形區(qū)域(長4 mm，寬0．8 mm)熒光強(qiáng)度的采集．并設(shè)計算法對檢測到的離散數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，構(gòu)建并根據(jù)“AT/AC～檢測物濃度”數(shù)學(xué)關(guān)系計算出待檢測物質(zhì)的濃度．通過大量生物實驗表明，掃描式熒光儀具有檢測速度快、可重復(fù)性高、數(shù)據(jù)線性關(guān)系好等優(yōu)點．此外，根據(jù)抗原、抗體結(jié)合的特異性，設(shè)計出對應(yīng)的熒光紙條，就能很好地對血液中不同物質(zhì)進(jìn)行快速檢測，而且儀器采用紫外LED作為激發(fā)光源以及光電二極管進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換，大大降低了儀器的成本．

圖8 AT/AC與稀釋倍數(shù)線性關(guān)系Fig．8 Dilution ratio AT/AC linear relationship

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Developing a Scanning-fluorescence Reader

ZHAO Zhonglong1，YANG Zhiwei1，WANG Hai1，ZHANG Jing2，MIN Xiaoping1，2*，GE Shengxiang2

( 1．School of Information Science and Engineering，Xiamen University，Xiamen 361005，China; 2．National Institute of Diagnostics and Vaccine Development In infection Diseases，Xiamen 361102，China)

Abstract:We developed portable scanning－fluorescence readers based on the time－resolved fluoroimmunoassay in order to quickly measure the concentration of antigen in blood point－of－care testing ( POCT)．An ultraviolet LED with laser operating at 365 nm is used in our experiment as the thermal source．The special optical structure can form a strip shot，which generated signal from fluorescence excitation．The device subsequently addresses waveform data using a gradient smoothing method．We measured the strips that are made by our laboratory，and show that the dilution ratio and AT/AC reach a correlation index of 0．994 3．The instruments enjoys advantages of high sensitivity，high stability，and low cost．

Key words:point－of－care－testing ( POCT) ; time－resolved fluoroimmunoassay; scanning－fluorescence reader

*通信作者:mxp@ xmu．edu．cn

收稿日期:2015－03－06錄用日期: 2015－05－13

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．023

中圖分類號:TH 776

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:0438－0479( 2016) 01－0121－05

引文格式:趙忠龍，楊志偉，王海，等．便攜掃描式熒光儀的研發(fā)［J］．廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016，55( 1) : 121－125．

Citation: ZHAO Z L，YANG Z W，WANG H，et al．Developing a scanning－fluorescence reader［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2016，55( 1) : 121－125．( in Chinese)