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    便攜掃描式熒光儀的研發(fā)

    2016-04-12 11:51:02趙忠龍楊志偉閔小平葛勝祥

    趙忠龍,楊志偉,王 海,張 晶,閔小平,*,葛勝祥

    ( 1.廈門大學(xué)信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建廈門361005; 2.廈門大學(xué)國家傳染病疫苗與診斷試劑研究工程中心,福建廈門361102)

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    便攜掃描式熒光儀的研發(fā)

    趙忠龍1,楊志偉1,王海1,張晶2,閔小平1,2*,葛勝祥2

    ( 1.廈門大學(xué)信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建廈門361005; 2.廈門大學(xué)國家傳染病疫苗與診斷試劑研究工程中心,福建廈門361102)

    摘要:為了能夠?qū)崿F(xiàn)對血液中特定抗原濃度的即時檢測( POCT),研制了基于時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的便攜式熒光儀.熒光儀以波長為365 nm的紫外LED作為激發(fā)光源,經(jīng)光學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生線光斑進(jìn)行掃描以及激發(fā)熒光信號,最后對光電二極管收集的光信號數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑、求斜率處理.使用該儀器對我們研發(fā)的紙條進(jìn)行檢測,并分析其靈敏度,結(jié)果表明稀釋倍數(shù)和檢測線面積/控制線面積( AT/AC)之間乘冪關(guān)系較好,相關(guān)系數(shù)為0.994 3.儀器靈敏度、穩(wěn)定性好,同時成本很低.

    關(guān)鍵詞:即時檢測;時間分辨熒光免疫分析;掃描式熒光儀

    目前,體外診斷行業(yè)的一個突出特點是它的兩極化發(fā)展趨勢,一極是大型自動化醫(yī)學(xué)檢驗儀器,另一極是小型即時檢測( point-of-care-testing,POCT)儀器.其中,POCT儀器檢測過程方便、快速且高效,獲得了市場越來越高的認(rèn)可度,在臨床應(yīng)用中的影響不斷擴(kuò)大[1-3].

    POCT型側(cè)向流紙條檢測技術(shù)結(jié)合定量免疫檢測技術(shù)在醫(yī)療保健、疾病診斷與防治等方面一直發(fā)揮著巨大的作用[4-5].類似的定量免疫檢測方法已有相關(guān)的報道.例如Li等[6]為量化上轉(zhuǎn)換發(fā)光( UCP)粒子并做出其圖像,研制出了二維光學(xué)掃描系統(tǒng),并將此系統(tǒng)應(yīng)用于上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒標(biāo)記免疫檢測.在功率為1.2 W,發(fā)光波長為980 nm的光纖耦合激光二極管上覆蓋一個透明的微流控芯片就可以激發(fā)UCP粒子發(fā)光,這種激發(fā)光可用光電倍增器( PMT)檢測.使用此掃描儀,從X和Y兩個方向掃描二維紙條只需要8 min[7].

    本文介紹了一種以時間分辨熒光免疫分析為生物依據(jù)的掃描式熒光儀[8-10].它采用光纖作收發(fā)光的通道,光學(xué)掃描采用線掃描的方式,避免了點掃描的局部性和不穩(wěn)定性.采用16位的AD轉(zhuǎn)換器將高靈敏度光電二極管捕捉到的光信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號,并對收集到的數(shù)字信號進(jìn)行分析,建立相關(guān)的數(shù)學(xué)模型,為后面的定量分析做基礎(chǔ).儀器相對其他設(shè)備而言,在保證檢測靈敏度的同時,成本低、穩(wěn)定性好.

    1實現(xiàn)方法及原理

    1. 1時間分辨熒光免疫分析

    熒光免疫分析是熒光檢測技術(shù)和免疫學(xué)反應(yīng)相互結(jié)合起來的一種免疫分析方法.其基本實現(xiàn)方法如下:使用某種特異性抗體,在其上標(biāo)記熒光基團(tuán)使之成為特異性試劑,與對應(yīng)抗原結(jié)合形成復(fù)合物[11-12].

    使用時間分辨熒光免疫技術(shù)進(jìn)行檢測時,激發(fā)光激發(fā)標(biāo)記物后適當(dāng)延遲一段時間再對標(biāo)記物熒光進(jìn)行檢測,可以提升檢測靈敏性,降低本底熒光干擾,增強(qiáng)穩(wěn)定性和特異性.而且還具有線性范圍更寬,試劑壽命更長的優(yōu)點[13-14].

    1. 2熒光儀紙條檢測原理

    熒光儀紙條檢測原理如圖1所示:在檢測紙條上面貼有一層硝酸纖維素膜,用于固定抗原抗體結(jié)構(gòu).

    紙條前端是質(zhì)控線( control),質(zhì)控線由包被羊抗鼠抗體和單克隆抗體(含熒光微球)組成,包被羊抗鼠抗體可以自動識別單克隆抗體,并形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu).所以質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度基本固定,用于判斷紙條是否合格.

    紙條后端是檢測線( test),它由包被單克隆抗體和單克隆抗體組成,這兩者不會結(jié)合,但是分別都可以和抗原結(jié)合,從而形成一個包被單克隆抗體+抗原+單克隆抗體的夾心結(jié)構(gòu),抗原越多,與之穩(wěn)定結(jié)合固定在硝酸纖維素膜上的熒光微球越多,從而可以判斷熒光強(qiáng)度.

    圖1熒光紙條檢測原理Fig.1 Strip detection principle of fluorometer

    掃描式熒光儀使用的紙條結(jié)構(gòu)如圖2所示.

    圖2紙條結(jié)構(gòu)平面圖Fig.2 Structure of the test strip

    2光學(xué)設(shè)計

    光學(xué)模塊是掃描式熒光儀的核心模塊,它控制著儀器信號源,對光信號進(jìn)行傳播和接收,決定著儀器最終檢測結(jié)果[15].所以在光學(xué)模塊設(shè)計過程中,需要提高激發(fā)光光源工作穩(wěn)定性,降低激發(fā)光傳輸衰減度.為此,選擇高靈敏度光電二極管( ODA-6WB-500M)和石英光纖,具體如圖3所示.

    從圖3可知,發(fā)射光源1負(fù)責(zé)紫外光的產(chǎn)生,濾光片3用于過濾發(fā)射光源,光探測單元2負(fù)責(zé)接收熒光紙條7反射的熒光信號,濾光片4負(fù)責(zé)對所接收到的光信號進(jìn)行濾波處理.其中光纖(呈Y型)負(fù)責(zé)對光形狀轉(zhuǎn)換傳遞等,具體如圖4所示.

    從圖4可知,左端通光2連接LED燈接口,用于傳播LED燈發(fā)射的紫外光.在最右端將柱形光轉(zhuǎn)成切面為條形的光(長度等于紙條上檢測線寬度),由右端通光2照射到紙條上.

    圖3光學(xué)模塊設(shè)計圖Fig.3 Design of the optical module

    圖4光纖刨面圖Fig.4 Cross-section of the optical fiber

    在紫外光的照射下,紙條上的熒光顆粒就會被激發(fā)出熒光,右端通光1將此熒光傳遞給左端通光1供光電二極管接收.

    光電二極管將接收到的熒光經(jīng)過處理,傳遞給模數(shù)轉(zhuǎn)換芯片進(jìn)行下一步的處理.

    3數(shù)據(jù)處理

    3. 1讀值檢測原理

    對紙條進(jìn)行一次掃描,可以檢測到兩個熒光波峰,記錄下兩個波形面積之比,然后利用濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)紙條進(jìn)行大批量生物實驗,建立如下數(shù)學(xué)關(guān)系:“檢測線面積/控制線面積( AT/AC)~檢測物試劑濃度”.最后利用建立起來的數(shù)學(xué)模型去判斷未知的檢測試劑濃度.

    3.2算法過程

    在數(shù)學(xué)中,針對連續(xù)的數(shù)學(xué)模型,我們使用求導(dǎo)并對導(dǎo)函數(shù)分析來獲得某曲線的波峰信息.

    根據(jù)此思想,一次檢測完成,獲得模數(shù)轉(zhuǎn)換以后的1 200個熒光數(shù)據(jù)點( Data[1 200])如圖5,做如下處理:

    圖5原始數(shù)據(jù)示意圖Fig.5 Origin data

    3. 2. 1平滑處理

    對于得到的原始數(shù)據(jù),會有鋸齒數(shù)據(jù)存在,對此我們要先進(jìn)行平滑處理:

    3. 2. 2求斜率

    過濾掉鋸齒數(shù)據(jù)之后,就可以求Smooth[1 200]的斜率.由于操作點是離散點,所以我們借用求導(dǎo)的原理(圖6) :

    圖6求導(dǎo)原理Fig.6 Principle of derivation

    其中: ( x1,y1),( x2,y2)為相鄰的點,這里使用了一個長度為2的窗口進(jìn)行滑動.當(dāng)前點的斜率可表示為:

    其中,i的取值范圍5~1 195.Slope[1 200]如圖7所示.

    圖7斜率示意圖Fig.7 Slope data

    3.2.3求面積

    在求面積之前,首先要找到波峰的起始點.

    在求起始點時,為了精確,對Slope數(shù)據(jù)進(jìn)行大量實驗確定滑動窗口為10,即從Data[i]到Data[i+9]共10個點的平均值作為當(dāng)前點的斜率.

    起點:

    要得到終點,就需要先找出開始下降的點.下降點:

    終點:

    其中,j的范圍為: 10~1 190.

    最后一步求面積,假設(shè):基線值、波峰寬度、毛面積、凈面積依次如下:

    通過以上分析,即可得到圖5中波峰的信息,具體如表1所示.

    4性能分析

    表1波峰檢測結(jié)果Tab.1 Result of peak recognition

    為了測試熒光儀的靈敏度,用其來檢測血液中丙型肝炎病毒抗原( HCV)的濃度.

    控制線( C線)為羊抗鼠多抗,檢測線( T線)為12F12抗體(起包被作用),樣品墊中為W4G3抗體(含熒光顆粒,起標(biāo)記作用).

    在吸收墊的作用下,血液中的HCV抗原、12F12抗體、W4G3抗體在T線處結(jié)合均形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu),W4G3和羊抗鼠多抗在C線處結(jié)合成穩(wěn)定結(jié)構(gòu).

    使用標(biāo)準(zhǔn)紙條進(jìn)行測試,對已知固定濃度樣本按不同比例進(jìn)行稀釋,檢測得到AT/AC的值如表2所示.

    表2 AT/AC與稀釋倍數(shù)Tab.2 AT/AC and dilution ratio

    由AT/AC與稀釋倍數(shù)得到乘冪趨勢線如圖8所示.

    由圖8可知,AT/AC和稀釋倍數(shù)之間乘冪趨勢線,相關(guān)系數(shù)R2= 0.994 3,說明在稀釋倍數(shù)足夠大的時候,儀器檢測出的值逐漸趨于一致,這與我們預(yù)計的一致,也進(jìn)一步說明該儀器靈敏度高.

    5結(jié)論

    本文主要介紹以時間分辨熒光免疫分析技術(shù)為生物檢測原理實現(xiàn)掃描式熒光儀的研發(fā).掃描式熒光儀工作時,紫外LED燈發(fā)出的光經(jīng)過光學(xué)結(jié)構(gòu)后,以條形光束照射在熒光顆粒標(biāo)記的紙條上,模數(shù)轉(zhuǎn)換器將高靈敏度光電二極管檢測到的熒光信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號,交由處理器,至此完成一個條形區(qū)域(長4 mm,寬0.8 mm)熒光強(qiáng)度的采集.并設(shè)計算法對檢測到的離散數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,構(gòu)建并根據(jù)“AT/AC~檢測物濃度”數(shù)學(xué)關(guān)系計算出待檢測物質(zhì)的濃度.通過大量生物實驗表明,掃描式熒光儀具有檢測速度快、可重復(fù)性高、數(shù)據(jù)線性關(guān)系好等優(yōu)點.此外,根據(jù)抗原、抗體結(jié)合的特異性,設(shè)計出對應(yīng)的熒光紙條,就能很好地對血液中不同物質(zhì)進(jìn)行快速檢測,而且儀器采用紫外LED作為激發(fā)光源以及光電二極管進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換,大大降低了儀器的成本.

    圖8 AT/AC與稀釋倍數(shù)線性關(guān)系Fig.8 Dilution ratio AT/AC linear relationship

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    Developing a Scanning-fluorescence Reader

    ZHAO Zhonglong1,YANG Zhiwei1,WANG Hai1,ZHANG Jing2,MIN Xiaoping1,2*,GE Shengxiang2

    ( 1.School of Information Science and Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China; 2.National Institute of Diagnostics and Vaccine Development In infection Diseases,Xiamen 361102,China)

    Abstract:We developed portable scanning-fluorescence readers based on the time-resolved fluoroimmunoassay in order to quickly measure the concentration of antigen in blood point-of-care testing ( POCT).An ultraviolet LED with laser operating at 365 nm is used in our experiment as the thermal source.The special optical structure can form a strip shot,which generated signal from fluorescence excitation.The device subsequently addresses waveform data using a gradient smoothing method.We measured the strips that are made by our laboratory,and show that the dilution ratio and AT/AC reach a correlation index of 0.994 3.The instruments enjoys advantages of high sensitivity,high stability,and low cost.

    Key words:point-of-care-testing ( POCT) ; time-resolved fluoroimmunoassay; scanning-fluorescence reader

    *通信作者:mxp@ xmu.edu.cn

    收稿日期:2015-03-06錄用日期: 2015-05-13

    doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2016.01.023

    中圖分類號:TH 776

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號:0438-0479( 2016) 01-0121-05

    引文格式:趙忠龍,楊志偉,王海,等.便攜掃描式熒光儀的研發(fā)[J].廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,55( 1) : 121-125.

    Citation: ZHAO Z L,YANG Z W,WANG H,et al.Developing a scanning-fluorescence reader[J].Journal of Xiamen University( Natural Science),2016,55( 1) : 121-125.( in Chinese)

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