日本囊對(duì)蝦Na-K-2Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與組織表達(dá)分析

劉洪濤，王　軍，毛　勇，喬　瑩，鐘聲平，蘇永全

(廈門(mén)大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建廈門(mén)361102)

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日本囊對(duì)蝦Na-K-2Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與組織表達(dá)分析

劉洪濤，王軍，毛勇，喬瑩，鐘聲平，蘇永全*

(廈門(mén)大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建廈門(mén)361102)

摘要:利用反轉(zhuǎn)錄PCR( RT－PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增( RACE)等技術(shù)在鰓組織中獲得日本囊對(duì)蝦( Marsupenaeus japonicus) Na－K－2Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白( NKCC) cDNA全序列，包含14 bp的5'非編碼區(qū)( 5'－UTR)、201 bp的3'－UTR和3 183 bp的開(kāi)放閱讀框( ORF)．該ORF共編碼1 060個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為117．051 ku，理論等電點(diǎn)為6．57，命名為Mj－NKCC．預(yù)測(cè)Mj－NKCC二級(jí)結(jié)構(gòu)由10個(gè)跨膜區(qū)組成，跨膜區(qū)的氨基酸序列和布局均相對(duì)保守．同源對(duì)比結(jié)果顯示，Mj－NKCC的氨基酸序列與夏威夷海蝕洞蝦( Halocaridina rubra)的Na－K－2Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似度最高，為77%．系統(tǒng)進(jìn)化分析表明Mj－NKCC與夏威夷海蝕洞蝦、藍(lán)蟹( Callinectes sapidus)等甲殼動(dòng)物的NKCC聚為一支．實(shí)時(shí)熒光定量PCR( qRTPCR)分析表明，Mj-NKCC基因在肝胰腺、鰓、胃、腸、心、眼柄、肌肉和血細(xì)胞中均有表達(dá)，鰓組織中表達(dá)量最高;在鹽度驟變時(shí)，該基因表達(dá)變化顯著，表明其很可能參與了對(duì)蝦的滲透壓調(diào)節(jié)，在對(duì)蝦的滲透平衡中發(fā)揮重要作用．

關(guān)鍵詞:日本囊對(duì)蝦; Na－K－2Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白( NKCC) ;基因克隆;組織表達(dá);鹽度驟變

日本囊對(duì)蝦( Marsupenaeus japonicus)屬甲殼綱( Crustacea)，十足目( Decapoda)，對(duì)蝦科( Penaeidae)，囊對(duì)蝦屬( Marsupenaeus)，在我國(guó)黃海、東海和南海海域均有分布，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦類［1］．日本囊對(duì)蝦屬海水廣鹽性對(duì)蝦，適宜的鹽度范圍是15～34，但對(duì)水體鹽度的變化較為敏感．陳堅(jiān)等［2］研究發(fā)現(xiàn)低鹽度對(duì)日本囊對(duì)蝦生長(zhǎng)和存活率的影響較為明顯．李才文等［3］證實(shí)鹽度變化能夠影響對(duì)蝦的免疫狀況，鹽度升降和偏離正常生存鹽度范圍均使對(duì)蝦抗感染力降低，成為病毒病爆發(fā)的重要誘因．因此，研究日本囊對(duì)蝦對(duì)鹽度的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的理論意義和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值．

Na－K－2Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白( NKCC)是動(dòng)物中廣泛存在的一類電中性離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，基本上均以1Na∶1K∶2Cl的形式負(fù)責(zé)同向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)Na、K、Cl離子進(jìn)出上皮細(xì)胞與非上皮細(xì)胞，在上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞體積和離子濃度的維持和調(diào)節(jié)、滲透壓平衡和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控等方面均發(fā)揮重要生理功能［4］．NKCC基因在高等脊椎動(dòng)物中研究已較為深入，而無(wú)脊椎動(dòng)物中研究較少．Sun等［5］研究果蠅( Drosophila melanogaster)時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)CG4357蛋白，其與SLC12家族的第一分支存在較高的同源性，經(jīng)證實(shí)其確為NKCC的昆蟲(chóng)同源類似物．目前在藍(lán)蟹( Callinectes sapidus)、岸蟹( Carcinus maenas)、張口蟹( Chasmagnathus granulata)和中華絨螯蟹( Eriocheir sinensis) 4種蟹類和1種夏威夷海蝕洞蝦( Halocaridina rubra)中已獲得NKCC基因序列，且其表達(dá)隨鹽度變化上調(diào)［6－8］，但尚未見(jiàn)對(duì)蝦類NKCC基因的相關(guān)報(bào)道．本實(shí)驗(yàn)成功克隆日本囊對(duì)蝦NKCC基因( Mj-NKCC) cDNA全序列，并分析其在日本囊對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)，以及在環(huán)境鹽度發(fā)生驟變時(shí)的表達(dá)變化，可為研究甲殼動(dòng)物離子通道與滲透調(diào)節(jié)機(jī)制積累基礎(chǔ)資料．

1材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)材料和試劑

實(shí)驗(yàn)用日本囊對(duì)蝦購(gòu)自福建省漳州市東山縣，體長(zhǎng)為( 10．44±0．12) cm，體質(zhì)量為( 14．05±0．86) g，暫養(yǎng)于2．5 m×2 m×1．5 m室內(nèi)水泥池中．暫養(yǎng)一周后，隨機(jī)選取6尾身體完整無(wú)損傷的健康個(gè)體，取其肝胰腺、鰓、胃、腸、心、肌肉、眼柄和血細(xì)胞迅速置于液氮中保存?zhèn)溆茫?/p>

RNAiso Plus總RNA提取試劑、PrimerScriptTM反轉(zhuǎn)錄酶、pMD19－T載體、Taq酶、TdT末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶、Ex Taq酶、dATP、PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Dimer EraserTM均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司( TaKaRa) ; DNA純化通用試劑盒、高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒購(gòu)自廈門(mén)鷺隆生物有限公司;其他常用試劑耗材購(gòu)自廈門(mén)太陽(yáng)馬生物有限公司．

表1日本囊對(duì)蝦NKCC基因克隆與表達(dá)分析所用引物Tab．1 Primers used for cloning and expression analysis of Mj-NKCC gene

1. 2引物設(shè)計(jì)

以日本囊對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中與NKCC基因高度相似的unigene片段作為模板，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5．0［9－10］和分析軟件Oligo 6．0設(shè)計(jì)中間片段擴(kuò)增引物，并利用克隆獲得的cDNA片段分別設(shè)計(jì)cDNA 3'末端快速擴(kuò)增( 3'－RACE)和5'－RACE巢式PCR引物．以日本囊對(duì)蝦翻譯延伸因子基因( EF1-α)作為內(nèi)參基因，根據(jù)獲得的Mj-NKCC全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR( qRT－PCR)引物．所有引物(表1)均由深圳華大基因有限公司合成．

1. 3 Mj-NKCC cDNA克隆

參照RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)提取日本囊對(duì)蝦鰓組織總RNA，取5 μL進(jìn)行1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用ND－1000超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)和純度．用于cDNA克隆的3'－RACE和5'－RACE模板參照孫田田等［11］實(shí)驗(yàn)方法制備．

利用5對(duì)引物擴(kuò)增和驗(yàn)證Mj-NKCC cDNA的中間片段，PCR反應(yīng)體系( 50 μL) :無(wú)菌雙蒸水( DDW) 37．5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP ( 2．5 mmol/L each) 4 μL，正反向引物( 10 nmol/mL)各1 μL，Taq酶( 2．5 U/ μL) 0．5 μL，cDNA模板1 μL．PCR反應(yīng)程序: 95℃5 min; 95℃45 s，55℃60 s，72℃90 s，36個(gè)循環(huán); 72 ℃10 min．PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，將純化產(chǎn)物連接至pMD19－T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于添加氨芐青霉素的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序即獲得目的片段序列．

利用3'－RACE的巢式PCR引物依次進(jìn)行3'末端序列的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系( 50 μL) : DDW 37．5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP ( 2．5 mmol/L each) 4 μL，RA引物( 20 nmol/L) 1 μL，F(xiàn)F1/FF2引物( 10 nmol/mL)各1 μL，Ex Taq酶( 2．5 U/μL) 0．5 μL，cDNA第一鏈模板/第一輪巢式PCR稀釋產(chǎn)物1 μL．按照不同的引物設(shè)置適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟葋?lái)進(jìn)行擴(kuò)增，第二輪巢式PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，按照上文步驟進(jìn)行克隆測(cè)序，所得即為3'末端序列．

利用引物RR1、RR2和Oligo dT－RA、RA，及制備的5'－RACE模板進(jìn)行5'末端序列的巢式PCR擴(kuò)增，操作步驟同3'－RACE．

隨著人們生活水平的提高，腦卒中偏癱患者對(duì)后期康復(fù)和生活質(zhì)量改善的需求也日益增多，雖然在住院期間患者能夠享受較完善的護(hù)理服務(wù)，但出院后由于醫(yī)療條件和環(huán)境限制，其后續(xù)的護(hù)理需求難以保障。延續(xù)性護(hù)理通過(guò)對(duì)出院患者提供以人為中心的全方位整體護(hù)理，可滿足偏癱患者出院后的護(hù)理需求。

1. 4生物信息學(xué)分析

利用DNASTAR 5．0軟件對(duì)所得片段進(jìn)行拼接和重疊序列的去除，確定開(kāi)放閱讀框( ORF)區(qū)域并推導(dǎo)出相應(yīng)氨基酸序列［12］．利用GenBank中BLAST工具( http:∥blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi)對(duì)所得的cDNA序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì)分析［13］．利用ClustalX軟件對(duì)核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析［14］．利用ProtParam程序( http:∥web．expasy．org/protparam/)統(tǒng)計(jì)氨基酸含量、預(yù)測(cè)理論分子質(zhì)量和等電點(diǎn)．利用在線分析軟件SignalP 4．1 Server ( http:∥www．cbs．dtu．dk/services/ SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析［15］．利用SMART ( http:∥smart．embl－h(huán)eidelberg．de/)進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析．利用PSIPRED( http:∥bioinf．cs．ucl．a(chǎn)c．uk/psipred/)和PredictProtein( http:∥www．predictprotein．org/)分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及活性調(diào)控位點(diǎn)．利用MEGA 6．06軟件的鄰接法( neighbor－joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分支置信度采用自展法( bootstrap analysis，BP)重復(fù)檢驗(yàn)1 000次［16］．

1. 5 Mj-NKCC mRNA表達(dá)的組織分布檢測(cè)

按照上文1．3小節(jié)中實(shí)驗(yàn)步驟提取日本囊對(duì)蝦肝胰腺、鰓、胃、腸、眼柄、心、肌肉、血細(xì)胞8種組織總RNA，并根據(jù)RNA總濃度添加適量的模板，按照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書(shū)制備cDNA模板．

qRT－PCR按照SYBR?Premix Dimer EraserTM說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，在ABI公司的7500快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，每個(gè)樣品的目的基因和內(nèi)參基因分別重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置未添加cDNA模板的陰性對(duì)照，PCR反應(yīng)體系( 20 μL) : SYBR?Premix Dimer EraserTM( 2×) 10 μL，引物( 10 μmol/L)各0．6 μL，ROX Reference DyeⅡ( 50×) 0．4 μL，cDNA模板2 μL，DDW 6．4 μL．反應(yīng)程序采用三步法: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃3 s，60℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)，采集熒光信號(hào); 60～95℃獲得熔解曲線．采用2－ΔΔCT法［17］用Excel 2013軟件分析表達(dá)數(shù)據(jù)，用Origin7．0軟件展示檢測(cè)結(jié)果．

1. 6 Mj-NKCC mRNA在鹽度驟變時(shí)表達(dá)變化的檢測(cè)

隨機(jī)選取100尾實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦于鹽度為25的水泥硬池中暫養(yǎng)2周，其他條件同1．1．將實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦平均分為2組，分別迅速轉(zhuǎn)移至鹽度為15和35的水泥池中，于0，3，6，12，24，48，72，96 h隨機(jī)選取5尾實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦，冰上解剖取鰓組織迅速置于液氮中保存?zhèn)溆茫畄RT－PCR實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析參照1．5小節(jié)．

2結(jié)　　果

將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)拼接獲得日本囊對(duì)蝦NKCC 的cDNA全序列( GenBank: KR063275)，命名為Mj-NKCC，其全長(zhǎng)為3 398 bp(圖1)．Mj-NKCC的cDNA包括5'非編碼區(qū)( 5'－UTR) 14 bp，3'－UTR 201 bp，ORF 3 183 bp; 3'－UTR包含典型的加尾信號(hào)序列( AATAAA)和13 bp的poly( A)序列．

Mj-NKCC的ORF共編碼1 060個(gè)氨基酸(圖1)，包含有92個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸( Arg和Lys)和95個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸( Asp和Glu)．ProtParam預(yù)測(cè)顯示: Mj－NKCC蛋白分子質(zhì)量為117．051 ku，等電點(diǎn)為6．57;預(yù)測(cè)GRAVY值為0．091，表明該蛋白為疏水蛋白;不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為36．90，顯示該蛋白是穩(wěn)定存在的;脂肪族指數(shù)為98．70，表明該蛋白具有較高的耐熱性．Mj－NKCC存在多種功能位點(diǎn)，包括13個(gè)糖基化位點(diǎn)、3個(gè)c A M P / c G M P依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、9個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、1 8個(gè)酪蛋白激酶C KⅡ磷酸化位點(diǎn)、1 6個(gè)豆蔻酰化位點(diǎn)和1個(gè)亮氨酸拉鏈基序．

圖1 Mj-NKCC的cDNA全長(zhǎng)序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig．1 The complete Mj-NKCC cDNA sequence and deduced amino acid sequence

利用SignalP4．1預(yù)測(cè)顯示Mj－NKCC蛋白的N端不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白．利用PSIPRED分析該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示其中α螺旋占43．30%，β折疊占10．19%，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占45．51%．利用Predict－Protein預(yù)測(cè)該蛋白亞細(xì)胞定位為細(xì)胞膜，可信度為76%．它具有10個(gè)跨膜區(qū)，分布在氨基酸序列的第123 ～583號(hào)殘基之間(圖1)，除第2，9，10個(gè)跨膜區(qū)為21，25，25個(gè)氨基酸殘基外，其他跨膜區(qū)均為18個(gè)氨基酸殘基，大片段的蛋白N末端和C末端均位于膜內(nèi)側(cè)．膜外序列在第5和第6個(gè)跨膜區(qū)之間存在1個(gè)酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)．

利用SMART分析發(fā)現(xiàn)該蛋白第120～634位氨基酸殘基之間有一個(gè)典型的Na－K－2Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AA _permease/SLC12A結(jié)構(gòu)域．

2. 2 Mj-NKCC多重比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

由Mj-NKCC cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列與夏威夷海蝕洞蝦、藍(lán)蟹等近緣物種的NKCC多重序列比對(duì)結(jié)果(圖2)表明，其蛋白跨膜區(qū)及布局相對(duì)保守，C端序列也相對(duì)保守，暗示這些片段對(duì)蛋白功能可能發(fā)揮重要作用．利用BLAST同源比對(duì)分析也發(fā)現(xiàn)，Mj－NKCC與其他物種的NKCC具有較高的同源性，其中與夏威夷海蝕洞蝦的NKCC相似度最高，為77%．系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)顯示Mj－NKCC(圖中▲標(biāo)示)首先與夏威夷海蝕洞蝦、藍(lán)蟹、岸蟹等節(jié)肢動(dòng)物的NKCC聚為一支，再與長(zhǎng)牡蠣( Crassostrea gigas)等軟體動(dòng)物的聚在一起并相對(duì)脊椎動(dòng)物獨(dú)立分支．

2. 3 Mj-NKCC mRNA的組織表達(dá)分析

qRT－PCR檢測(cè)Mj-NKCC mRNA在日本囊對(duì)蝦肝胰腺、鰓、胃、腸、心、肌肉、眼柄和血細(xì)胞8種組織中的表達(dá)，結(jié)果(圖4)顯示在8種組織中均有表達(dá)，以肝胰腺中表達(dá)量為對(duì)照，鰓中表達(dá)量最高，其后依次為血細(xì)胞、腸、胃、眼柄、心和肝胰腺，在肌肉中的表達(dá)量最低．

2. 4 Mj-NKCC mRNA在環(huán)境鹽度驟變時(shí)的表達(dá)變化

qRT－PCR檢測(cè)Mj-NKCC mRNA在日本囊對(duì)蝦應(yīng)對(duì)環(huán)境鹽度發(fā)生驟變時(shí)的表達(dá)變化，結(jié)果見(jiàn)圖5．鹽度由25驟降至15后3 h，Mj-NKCC mRNA相比0 h(對(duì)照組)顯著上調(diào)表達(dá)，約為其2．8倍，6 h和12 h時(shí)均維持在與3 h相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)量;至24 h時(shí)，表達(dá)量進(jìn)一步上調(diào)，相比0 h差異極顯著( p＜0．01)，約為其8．4倍;后雖有下調(diào)，但與0 h差異仍極顯著( p＜0．01) ;而在鹽度由25驟升至35后，Mj-NKCC mRNA表達(dá)量雖出現(xiàn)波動(dòng)變化，但除72 h時(shí)的表達(dá)量相比0 h表現(xiàn)出顯著上調(diào)外( p＜0．05)，其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量與0 h差異均不顯著．

3討論

NKCC屬于電中性的陽(yáng)離子－氯轉(zhuǎn)運(yùn)家族( CCCs)，目前的研究表明該家族包括9種轉(zhuǎn)運(yùn)子，分別為1個(gè)Na/Cl共轉(zhuǎn)運(yùn)子、4個(gè)K/Cl共轉(zhuǎn)運(yùn)子、2個(gè)Na/K/Cl共轉(zhuǎn)運(yùn)子和2個(gè)尚不清楚功能的新發(fā)現(xiàn)的膜蛋白［18－19］．本實(shí)驗(yàn)利用RT－PCR和RACE等技術(shù)，成功獲得日本囊對(duì)蝦NKCC基因( Mj-NKCC)的全長(zhǎng)cDNA序列．NKCC為一類跨膜糖蛋白，分子質(zhì)量為120～200 ku，Mj－NKCC經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞膜上，氨基酸序列中含有13個(gè)N－糖基化位點(diǎn)，在胞內(nèi)和胞外區(qū)域均有分布，與Reshkin等［20］在兔腮腺中的研究發(fā)現(xiàn)基本一致．同源分析表明Mj－NKCC與夏威夷海蝕洞蝦、藍(lán)蟹、果蠅等的NKCC同源性很高，其中與夏威夷海蝕洞蝦的NKCC相似度最高，為77%，說(shuō)明NKCC在不同物種間較為保守．進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示Mj－NKCC首先與甲殼動(dòng)物NKCC聚為一個(gè)分支，后與果蠅等節(jié)肢動(dòng)物和長(zhǎng)牡蠣、玻璃海鞘等軟體動(dòng)物的NKCC共同聚為一個(gè)大的分支，與高等脊椎動(dòng)物明顯分開(kāi)，表明借助NKCC的氨基酸序列對(duì)物種進(jìn)行的分子進(jìn)化研究與傳統(tǒng)的生物學(xué)分類基本吻合．

研究表明，NKCC蛋白功能的激活或抑制與該蛋白的磷酸化狀態(tài)息息相關(guān)．其活化后會(huì)促使其易位到胞膜上執(zhí)行功能［21］．Darman等［22］研究了NKCC的N端磷酸化狀態(tài)對(duì)其蛋白的活性調(diào)控的影響，發(fā)現(xiàn)其末端存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可以與蛋白磷酸酶的SPAK、RVXF區(qū)域結(jié)合從而調(diào)控NKCC的活性;并發(fā)現(xiàn)Thr189的磷酸化對(duì)于HEK－293細(xì)胞表達(dá)的鯊魚(yú)( Squalus acanthias) NKCC蛋白的活性是必要條件，而Thr184和Thr202的磷酸化則起調(diào)控作用．Flatman等［23］在關(guān)于磷酸化和蛋白間相互作用對(duì)NKCC活性調(diào)控的研究中證實(shí)，NKCC中也存在蛋白激酶A、蛋白激酶C、酪蛋白激酶CKⅡ的結(jié)合位點(diǎn)．Diecke等［24］的研究還證實(shí)MAPKs、CaMKⅡ以及cAMP/cGMP－PK均可以使NKCC磷酸化．Mj－NKCC的氨基酸序列含有3 個(gè)cAMP/cGMP依賴型蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、9個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、18個(gè)酪蛋白激酶CKⅡ磷酸化位點(diǎn)、膜外序列在第5和第6個(gè)跨膜區(qū)之間有1個(gè)酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)．因此Mj－NKCC磷酸化/去磷酸化狀態(tài)的調(diào)控，可能對(duì)其在日本囊對(duì)蝦滲透壓維持和調(diào)節(jié)、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控以及細(xì)胞周期等方面產(chǎn)生重要影響．

圖2 Mj－NKCC氨基酸序列的多重比對(duì)Fig．2 Amino acid sequences of Mj－NKCC aligned with the NKCC sequences from other species

CCCs家族中NKCC與其他轉(zhuǎn)運(yùn)子在不同的物種間存在25%～67%的相似度，但二級(jí)結(jié)構(gòu)均較為相似，跨膜區(qū)為8～12個(gè)疏水性氨基酸構(gòu)成的螺旋，膜內(nèi)區(qū)由親水性的N端和C端組成［25］．Mj－NKCC包含10個(gè)跨膜區(qū)，N端和C端均在細(xì)胞膜內(nèi)．NKCC跨膜區(qū)的氨基酸組成和分布均相對(duì)保守，研究發(fā)現(xiàn)其N(xiāo)端序列相差較大但C端序列相對(duì)保守，不同物種間擁有65%的相同氨基酸組成［26］．Mj－NKCC與藍(lán)蟹、果蠅等的NKCC多重對(duì)比分析表明其跨膜區(qū)和C端序列均較為保守，N端序列不同物種間差異較大．跨膜區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)Mj－NKCC與其他物種相比第2，9，10個(gè)跨膜區(qū)長(zhǎng)度變異較大，第2，4，5，6，7個(gè)跨膜區(qū)氨基酸差異較大，提示其可能與物種特異性有關(guān)．

Isenring等［27］通過(guò)構(gòu)建鯊魚(yú)與人的NKCC嵌合體進(jìn)行點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NKCC基因的離子結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)及bumetanide抑制結(jié)合的能力，都依賴相對(duì)保守的疏水跨膜結(jié)構(gòu)．該跨膜結(jié)構(gòu)在不同亞型乃至不同物種間都是非常保守的［28］．各跨膜區(qū)的離子動(dòng)力學(xué)特性不同，可能具有物種特異性，其中第2個(gè)跨膜區(qū)的氨基酸突變會(huì)影響對(duì)Na、K等陽(yáng)離子的親和力，而第4～7個(gè)跨膜區(qū)的氨基酸組成則對(duì)Cl離子的親和力起決定作用［29］．Mj－NKCC具有與CCCs家族NKCC高度同源的AA_permease/SLC12A結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域定位于跨膜區(qū)，并且根據(jù)上文分析Mj－NKCC第2，4，5，6，7個(gè)跨膜區(qū)序列與其他物種差異較大，推測(cè)這些跨膜區(qū)的氨基酸變異是日本囊對(duì)蝦廣鹽性適應(yīng)的重要原因．Mj－NKCC各跨膜區(qū)的具體功能尚需進(jìn)一步研究．

圖3基于NKCC氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig．3 The neighbor－joining( NJ) phylogenetic tree constructed based on NKCC amino acid sequences

圖4 Mj-NKCC mRNA的組織表達(dá)分布Fig．4 Expression of Mj-NKCC mRNA in different tissues

海產(chǎn)甲殼動(dòng)物，其對(duì)鹽度的適應(yīng)能力主要體現(xiàn)在對(duì)滲透壓和離子濃度的調(diào)節(jié)能力上，而這種調(diào)節(jié)主要由鰓來(lái)完成．鰓的上皮含有顆粒細(xì)胞、腎原細(xì)胞、柱形細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，從而調(diào)控和維持外界水環(huán)境與血淋巴的滲透平衡，執(zhí)行呼吸、排泄、滲透壓調(diào)節(jié)甚至病害防御等功能，而位于這些細(xì)胞基底側(cè)質(zhì)膜的NKCC的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)將發(fā)揮重要作用［27－28，30－31］．利用qRT－PCR技術(shù)檢測(cè)NKCC基因在日本囊對(duì)蝦的鰓、肝胰腺、腸、血細(xì)胞、胃、心、眼柄和肌肉8種組織中的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Mj-NKCC mRNA在這些組織中均有表達(dá)，在鰓中表達(dá)量最高．進(jìn)一步的鹽度驟變實(shí)驗(yàn)表明，Mj-NKCC mRNA在鹽度發(fā)生驟變時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)明顯變化，在鹽度驟升后72 h和驟降后3～12 h表達(dá)量變化差異達(dá)到顯著水平，在鹽度驟降后24～96 h表達(dá)量變化差異達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明Mj-NKCC基因很可能參與了日本囊對(duì)蝦的滲透壓調(diào)節(jié)過(guò)程．有研究報(bào)告對(duì)夏威夷海蝕洞蝦多種滲透相關(guān)基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NKCC除鹽度由32驟降至2時(shí)顯著地上調(diào)表達(dá)外，其他鹽度驟變的實(shí)驗(yàn)組表達(dá)波動(dòng)均不顯著，這可能與物種及環(huán)境不同有關(guān)，相比而言夏威夷海蝕洞蝦的環(huán)境鹽度變化更為劇烈與頻繁［8］．綜上所述，可以推測(cè)Mj-NKCC基因在日本囊對(duì)蝦鰓的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和滲透平衡中發(fā)揮重要作用．

圖5 Mj-NKCC mRNA在環(huán)境鹽度驟變時(shí)的表達(dá)Fig．5 Expression of Mj-NKCC mRNA after the salinity changes in environment

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Molecular Cloning and Expression Analysis of Na-K-2Cl Cotransporter from Marsupenaeus japonicus

LIU Hongtao，WANG Jun，MAO Yong，QIAO Ying，ZHONG Shengping，SU Yongquan*

( College of Ocean and Earth Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China)

Abstract:Na－K－2Cl cotransporter gene ( Mj-NKCC) from Marsupenaeus japonicus was obtained using reverse transcription PCR( RT－PCR) and rapid amplication of cDNA ends ( RACE) in this study．Results show that the full－length cDNA sequence of Mj-NKCC consists of a 14－bp 5' untranslated regions ( 5'－UTR)，a 201－bp 3'－UTR and a 3 183－bp open reading frame ( ORF)．The deduced amino acids sequence is composed of 1 060 amino acids，with molecular weight of 117．051 ku and isoelectric point of 6．57．The predicted second structure of Mj－NKCC contains 10 transmembrane domains，which are highly conserved in sequences and localization sites compared to other species．Multiple alignments of the amino acid sequences show that Mj－NKCC has the highest homology with Callinectes sapidus ( up to 77%)，and the phylogenetic analysis indicated that it was first clustered together with C．sapidus and Carcinus maenas．Additionally，the quantitative real－time PCR ( qRTPCR) results displayed that Mj-NKCC was expressed in hepatopancreas，gills，stomach，muscle，heart，eyestalk，intestine and hemocytes，with the highest expression level in gills．As the salinity changed sharply，significant changes occurred in the expression of Mj-NKCC，indicating that Mj-NKCC putatively participates in osmotic balance of shrimps and plays an important role in osmoregulation of shrimps．

Key words:Marsupenaeus japonicus; Na－K－2Cl cotransporter ( NKCC) ; molecular cloning; tissue expression; salinity change

*通信作者:yqsu@ xmu．edu．cn

基金項(xiàng)目:國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃( 863計(jì)劃) ( 2012AA10A409) ;國(guó)家星火計(jì)劃( 2015GA720002) ;國(guó)家蝦產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位專家項(xiàng)目( CARS－47) ;福建省科技廳區(qū)域重大項(xiàng)目( 2013N3004) ;廈門(mén)市南方海洋中心項(xiàng)目( 14CZY033HJ07)

收稿日期:2015－05－07錄用日期: 2015－09－16

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．009

中圖分類號(hào):Q 785; S 917．4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):0438－0479( 2016) 01－0046－09

引文格式:劉洪濤，王軍，毛勇，等．日本囊對(duì)蝦Na－K－2Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與組織表達(dá)分析［J］．廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，55( 1) : 46－54．

Citation: LIU H T，WANG J，MAO Y，et al．Molecular cloning and expression analysis of Na－K－2Cl cotransporter from Marsupenaeus japonicus［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2016，55( 1) : 46－54．( in Chinese)