苦參抑菌活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)與作用機理

韓寶艷++紀(jì)明山++劉妍++沈儉龍

摘要：采用硅膠柱層析和HPLC分離技術(shù)從苦參中獲得1個抗病原真菌化合物，采用質(zhì)譜和核磁共振波譜等技術(shù)鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并評價了其對番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌的菌絲生長、產(chǎn)孢的抑制作用。經(jīng)過質(zhì)譜、核磁共振氫譜（1HNMRH）和碳譜（13CNMR）鑒定，發(fā)現(xiàn)其為已知結(jié)構(gòu)苦參新醇X（kushenolX）。該物質(zhì)對番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌的菌絲均有抑制作用，當(dāng)處理濃度為200 mg/L時，對3種病原真菌的抑制率均在60%以上，其中對水稻稻瘟病菌的抑制率達到83.13%；該物質(zhì)對3種病原菌孢子產(chǎn)生也有較強抑制作用，200 mg/L下3種病原真菌的產(chǎn)孢抑制率均在80%以上。

關(guān)鍵詞：苦參；抑菌活性；作用機理；黃酮類化合物；病原真菌

中圖分類號： R284.1文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0170-03

收稿日期：2015-03-21

基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（編號：201303025）。

作者簡介：韓寶艷（1987—），女，碩士研究生，研究方向為生物農(nóng)藥。E-mail：dongfangyuling@163.com。

通信作者：紀(jì)明山，博士，教授，主要從事農(nóng)藥毒理學(xué)研究。E-mail：jimingshan@163.com。苦參（Sophora flavescens）別稱山槐子，為豆科槐屬植物?？鄥⑻崛∫旱幕瘜W(xué)成分主要為生物堿、黃酮2大類[1]。近年來國內(nèi)外研究苦參的重點在于生物堿，對黃酮類成分的研究較少。隨著分離技術(shù)不斷提高，進一步發(fā)現(xiàn)了苦參中黃酮類的多種藥理活性，引起了廣泛重視和興趣[2]。賈利元等在研究苦參提取物對茄子黃萎病菌的化感效應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，苦參生物堿處理的抑菌率均低于同濃度黃酮類化合物處理的抑菌率[3]。李巍等研究苦參黃酮抗滴蟲和抗菌等作用機制和構(gòu)效關(guān)系時，分離出5 - 甲氧基-7，2′，4′ - 三羥基- 8 - 異戊烯基二氫黃酮和3β，7，4′ - 三羥基-5 - 甲氧基-8 - 異戊烯基二氫黃酮2個新化合物[4]。截至2014年，已從苦參中分離出108個黃酮類化合物[5]。黃酮類化合物是多酚類植物的次級代謝產(chǎn)物，具有許多潛在的藥用價值和生物活性，其中抑菌活性是研究熱點之一[6]。鄭永權(quán)等以生物活性追蹤試驗為指導(dǎo)，從苦參提取物中分離出2個主要殺蟲抑菌活性化合物苦參酮和槐屬二氫黃酮G[7]。Kuroyanagi從苦參中分離出23種化合物，12種為新分離出的化合物，其中8種為異戊烯黃烷酮類，這些化合物都顯示出明顯的抗菌作用[8]。國內(nèi)外對苦參黃酮類化合物抑菌作用的研究集中在抗菌能力測定，有關(guān)作用機理的研究甚少。本研究采用硅膠柱色譜法、HPLC、質(zhì)譜、核磁共振對苦參黃酮類中抑菌活性成分進行分離鑒定，通過菌絲生長速率法檢測其對番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium ）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的抑菌效果，并對該活性成分的作用機理進行初步研究，以期為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試植物樣品

苦參，自然曬干，用粉碎機粉碎備用。

1.2供試菌

番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實驗室提供。

1.3試劑

95%乙醇溶液、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚等均為分析純。

1.4活性成分的提取與分離

將苦參粉碎物分別與95%乙醇溶液、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醚等按1 g ∶10 mL比例混合，靜置1 h，超聲頻率為90 kHz，經(jīng)超聲波清洗器振蕩提取1 h。浸提后過濾留濾液，棄去廢渣，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏[9-10]，分別進行生物活性測定。

選擇苦參抑菌活性較強的乙酸乙酯提取物進行硅膠柱層析，以體積比1 ∶10的甲醇-氯仿混合溶劑和體積比1 ∶15的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑為洗脫劑依次進行等梯度洗脫，等體積（50 mL）收集餾分，經(jīng)薄層層析檢測，將相同斑點合并，最終獲得2個餾分[11]。

經(jīng)過抑菌活性測定，選擇抑菌活性較強的餾分，采用反相制備HPLC（C18柱，5 μm，10 mm×250 mm；甲醇-水（體積比6 ∶4）等梯度洗脫，流速3 mL/min，柱溫30 ℃，波長297 nm，采集時間1 h，進一步純化，獲得到化合物A。

3結(jié)論與討論

在制備供試品時，本研究考察了不同溶劑（95%乙醇溶液、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醚） 超聲提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯超聲提取法獲得的物質(zhì)對番茄灰霉病菌的抑制作用最強。對粗提物進一步分離純化，獲得了苦參新醇X，查閱文獻發(fā)現(xiàn)，Kuroyanagi等在1999年將苦參新醇X作為一種新化合物從苦參中分離出來[8]。

黃酮類化合物是一類植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于多種植物中，不僅數(shù)量、種類繁多，而且結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣[16]。黃酮類化合物是苦參主要成分之一。本研究分離鑒定出的苦參新醇X即二氫黃酮醇（黃烷酮醇），已有研究表明，該物質(zhì)對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌有較強的抑制作用。本研究表明，該物質(zhì)對番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌均有抑制作用。在200 mg/L處理下，其對水稻稻瘟病菌的抑制作用最高，抑制率達83.13%。本研究對其作用方式進行初步探討，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)雖然可以抑制這3種病原真菌的菌絲生長，但并未將菌絲殺死，一旦抑制作用解除，菌絲就恢復(fù)生長能力。苦參新醇X不僅對這3種病原真菌的菌絲起到抑制作用，對其孢子產(chǎn)生也具有強烈抑制作用，200 mg/L下產(chǎn)孢抑制率均在80%以上。本研究僅針對苦參黃酮類化合物進行了初步抑菌試驗及抑菌機理研究?？鄥ⅫS酮類化合物是否能夠抑制病原真菌內(nèi)部酶的活性，以及對病原真菌的能量代謝和物質(zhì)代謝有何種影響，還須進一步研究。

抗菌試驗使用的大多是粗提物，成分復(fù)雜，對黃酮單體的抑菌活性研究較少[6]。而且單體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作用機理不明確，抗菌研究不深入。這些都是應(yīng)用過程中必須解決的問題。

參考文獻：

[1]朱曉薇. 國外抗炎植物藥研究進展[J]. 國外醫(yī)藥：植物藥分冊，1998，13（2）：51-59.

[2]王靜妮，侯華新. 苦參中黃酮成分的藥理研究進展[J]. 海峽藥學(xué)，2006，18（1）：14-16.

[3]賈利元，張淑紅，張恩平，等. 苦參提取物對茄子黃萎病菌的化感效應(yīng)研究初報[J]. 中國蔬菜，2012（4）：43-47.

[4]李巍，梁鴻，尹婷，等. 中藥苦參主要黃酮類成分的研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報，2008，43（8）：833-837.

[5]張翅，馬悅，高慧敏，等. 苦參化學(xué)成分研究進展[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（4）：205-214.

[6]李葉，唐浩國，劉建學(xué). 黃酮類化合物抑菌作用的研究進展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008（12）：53-55，69.

[7]鄭永權(quán)，姚建仁，邵向東，等. 苦參殺蟲抑菌活性成分研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，1999，1（3）：91-93.

[8]Kuroyanagi M，Arakawa T，Hirayama Y，et al. Antibacterial and antiandrogen flavonoids from Sophora flavescens[J]. Journal of Natural Products，1999，62（12）：1595-1599.

[9]鄒姝姝，王貴學(xué). 中藥苦參中苦參堿類成分超聲波提取工藝[J]. 重慶大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，30（7）：130-133.

[10]董娟娥，馬柏林，劉麗，等. 超聲波提取杜仲葉中有效成分工藝研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報，2003，18（3）：66-68.

[11]李晶晶，曾東強. 牛耳楓果實中抑菌活性成分的初步分離[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2013，15（3）：261-266.

[12]周寶利，劉雙雙，靳曉冬，等. 苦參提取物抑制番茄灰霉病菌活性的研究[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，43（2）：143-147.

[13]胡林峰，朱紅霞，周琳，等. 7種中草藥抑菌活性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：131-132.

[14]蔣繼志，趙麗坤，史娟，等. 幾種真菌發(fā)酵液對致病疫霉的抑制作用[J]. 微生物學(xué)通報，2001，28（2）：55-59.

[15]吳翠霞. 白藜蘆醇及其衍生物的抑菌活性及對番茄早疫病菌的作用機理研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[16]延璽，劉會青，鄒永青，等. 黃酮類化合物生理活性及合成研究進展[J]. 有機化學(xué)，2008，28（9）：1534-1544.張鴻雁，劉勇，任勇洋. 人參銹腐病及疫病生防放線菌篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：173-176.