三種針法對PCPA失眠大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量的影響*

羅本華，王 燕，張亞飛，羅梅桂

(廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530001)

三種針法對PCPA失眠大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量的影響*

羅本華，王 燕，張亞飛，羅梅桂

(廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530001)

目的:觀察針刺失眠方、臍內(nèi)環(huán)穴及失眠方合臍內(nèi)環(huán)穴對PCPA失眠大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量影響，并對3種針法優(yōu)選。方法:70只大鼠經(jīng)隨機、PCPA失眠造模及篩選后共分6組各10只，正常組、模型組無特殊處理，3個觀察組分別給予針刺失眠方、針刺臍內(nèi)環(huán)穴、針刺失眠方合臍內(nèi)環(huán)穴干預，非穴組給予針刺非穴處理，治療6 d后取大鼠海馬勻漿，ELISA法檢測5-HT和5-HIAA含量。結(jié)果:PCPA模型大鼠海馬5-HT和5-HIAA明顯降低，3種針法均顯著升高5-HT、5-HIAA含量;而失眠方合臍內(nèi)環(huán)穴針刺作用更好，優(yōu)于2種單一方法并顯示其疊加作用。結(jié)論:3種針法可能通過升高海馬內(nèi)5-HT、5-HIAA含量而改善失眠，實驗支持失眠方合臍內(nèi)環(huán)穴針刺為失眠癥的優(yōu)選干預方法。

失眠;臍內(nèi)環(huán)針;失眠方;5-HT;5-HIAA

5-羥色胺(5-HT)在睡眠的調(diào)節(jié)過程中起著重要作用，是睡眠機制研究的重點之一。針刺失眠方、臍內(nèi)環(huán)穴針刺是流行于廣西地域治療失眠癥臨床常用且有效的方法。筆者近年常用二者結(jié)合治療失眠癥，取得較好的療效。為了解其對睡眠活動的調(diào)節(jié)機理，探討了3種針刺方法的差異。本實驗研究3種針刺對PCPA失眠模型大鼠海馬5-HT和5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)的含量影響，旨在為其臨床運用、方法優(yōu)選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物 健康SPF級Wistar雄性大鼠70只，體質(zhì)量(250±15)g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供;室溫20～25℃飼養(yǎng)，室內(nèi)采光按照白晝循環(huán)模式，定時喂食，自由飲水，適應性喂養(yǎng)15 d。

1.1.2 試劑 對氯苯丙氨酸(PCPA)試劑盒:美國Alfa Aesar(批號H30Y014);大鼠5-HT ELISA試劑盒、大鼠5-HIAA ELISA試劑盒:武漢基因美生物科技有限公司(批號201501、201501)。

1.1.3 儀器 低溫高速離心機:SIGMA3-18K，德國 Sigma公司產(chǎn)品;Bio-Tek 800酶標儀:美國BIO-RAD公司產(chǎn)品;洗板機:芬蘭 (Thermo Labsystems)公司產(chǎn)品;培養(yǎng)箱:HH.CP-01W;勻漿儀FLUKO-PRO200。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將70只Wistar大鼠分為正常組10只、預用模型復制大鼠60只。預用模型復制大鼠采用腹腔注射對氯苯丙氨酸法(PCPA)進行模型復制，篩選后將造模成功的50只大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、針刺失眠方組、臍內(nèi)環(huán)針組、失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組、非穴組5組各10只。

1.2.2 PCPA失眠模型制作 對氯苯丙氨酸(PCPA)，臨用前按大鼠45 mg/(1 ml·100 g)用量，用弱堿性生理鹽水(pH 7～8)配置成混懸液備用。于上午8∶00左右將大鼠按1 ml/100 g劑量腹腔注射PCPA混懸液，每日1次，連續(xù)注射2 d，在第2次腹腔注射PCPA 28～30 h后，動物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天活動不停，整體觀察與正常組有明顯不同者，表明模型復制成功。正常組腹腔注射相同體積的弱堿性生理鹽水。

1.2.3 針刺干預方法及療程 6組于造模成功后次日開始實驗干預治療。

(1)正常組與模型組不給予任何治療，只給予同臍內(nèi)環(huán)針組相同時間(4 min)及相同強度的抓摸刺激;(2)針刺失眠方組給予針刺失眠方穴治療。取穴［1］:雙側(cè)神門、支溝、足三里、三陰交。大鼠的神門在前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣，直刺1 mm;三陰交在后肢內(nèi)踝尖直上10 mm，直刺5 mm;足三里即后三里在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處，直刺7 mm;支溝穴在前肢外側(cè)，距腕關(guān)節(jié)4.5 mm左右的尺橈骨間，直刺1 mm。針刺方法:以25× 13 mm粗細的毫針刺入穴位相應的深度，針后行捻轉(zhuǎn)角度90°以內(nèi)90～180次/min的高頻小幅度捻轉(zhuǎn)手法，每穴行30 s后出針，每次共治療4 min;(3)臍內(nèi)環(huán)針組給予針刺臍內(nèi)環(huán)穴治療。取穴:臍內(nèi)環(huán)穴，取心肝脾肺腎6個穴點。臍內(nèi)環(huán)穴在大鼠神闕穴［1］旁開2.5 mm處做一圓環(huán)，環(huán)線上均是穴位(據(jù)上書神闕至中脘約20 mm拆算);以正上方為心，正下方為腎，右為肝，左為脾胃，左上、右上均為肺，共6個穴點。針刺方法:以25×13 mm粗細的毫針，由內(nèi)向外以10～15°刺入2～4 mm，針后不行捻轉(zhuǎn)提插手法，每穴點留針30 s共3 min;繼續(xù)抓摸1 min，每次共治療4 min;(4)失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組給予以上失眠方針刺加臍內(nèi)環(huán)針刺治療，每穴行30 s后出針，共治療7 min;(5)非穴組針刺雙側(cè)肋下各2個固定非穴點［2］，約相當于乳正中線外開2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm，每穴行90 s后出針，繼續(xù)抓摸1 min，每次共4 min。以上6組按相應干預方法，每日治療1次共6次。

1.2.4 大鼠海馬取材方法 針灸干預方案完成后第2天即處死各組動物，開顱迅速取出整腦，冰上分離各組大鼠海馬，冷生理鹽水中洗去血液，電子天平上稱重后置于－80℃冰凍保存?zhèn)溆么郎y。

1.2.5 大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量檢測 取海馬組織按1∶9比例加入0.9%氯化鈉溶液，組織勻漿器低溫下勻漿，4℃、3000 r/min離心20 min，取上清置于-20℃保存待測。采用雙抗體夾心法檢測5-HT、5-HIAA含量。按試劑盒說明書設立標準品孔、樣品孔和空白對照孔，標準品孔加入不同濃度的標準品50 μl。樣品孔先加待測樣本10 μl，再加樣本稀釋液40 μl。標準品孔和樣本孔每孔加入辣根酶標記抗體10 μl，37℃水浴鍋溫育60 min，后洗板5次，吸水紙拍干。每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min。加入終止液50 μl。450 nm波長測定各孔的吸光度(OD)值。計算機根據(jù)各標準品吸光度以及標準品濃度，計算檢測樣品5-HT、5-HIAA的含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

表1 各組大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量(ng/ml，±s)

表1 各組大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量(ng/ml，±s)

注:與正常組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例數(shù)5-HT 5-HIAA正 常 組10 129.7±22.2 66.2±10.7模 型 組 10 77.7±25.4##＊＊ 38.7±11.1##△△＊＊針 刺 失 眠 方 組 10 101.4±28.3#△＊ 55.8±12.9##△＊臍 內(nèi) 環(huán) 針 組 10 101.6±29.2#△＊ 54.2± 6.6##△＊失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組 10 125.4±24.8△△ 63.7±12.5△△非 穴 組 10 86.0±23.0##＊＊ 44.1± 9.7##△△＊＊

表1顯示，模型組PCPA失眠大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量均顯著低于正常組大鼠(P＜0.01);針刺失眠方組、臍內(nèi)環(huán)針組及失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組5-HT、5-HIAA含量均顯著高于模型組大鼠(P＜0.05);而失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組5-HT、5-HIAA含量均顯著高于其他針刺組(均P＜0.05)，與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

失眠的病機關(guān)鍵為水火失調(diào)、陰陽失衡。失眠穴方是治療失眠癥的針刺驗方［3］，主穴為神門、支溝、足三里、三陰交，立意瀉火補水，是針對失眠水火失調(diào)病機而設。臍內(nèi)環(huán)針是壯醫(yī)針刺的基礎(chǔ)針法和調(diào)氣方法，而臍內(nèi)環(huán)穴五臟點同取法是壯醫(yī)針刺頗具療效和研究基礎(chǔ)的失眠效方;究其理，臍內(nèi)環(huán)穴位于臍旁開0.5寸，能溝通任沖和調(diào)節(jié)先天后天;臍是機體三部人部所在，是臟腑信息全息處，結(jié)合針向迎隨，能調(diào)理全身臟腑和氣血;臍通五臟之神，善調(diào)五臟之氣，又起最基本的調(diào)氣調(diào)神作用，因而針刺臍內(nèi)環(huán)穴能整體調(diào)理臟腑陰陽氣血神氣，廣泛用于全身諸多疾病的整體調(diào)理。數(shù)年來，筆者驗證了單用臍內(nèi)環(huán)五臟點同取法［4］和失眠穴方［3］針刺治療失眠癥的療效，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合針刺［5-6］療效更優(yōu)，并確立其為失眠癥的研究方法，這樣既能有效地發(fā)揮臍內(nèi)環(huán)針整體治神調(diào)氣和近部臟腑調(diào)節(jié)的作用，又發(fā)揮失眠穴方肢體經(jīng)穴的遠治作用，更整體而全面地顧及失眠癥的臟腑經(jīng)絡調(diào)節(jié)、水火陰陽平衡。

睡眠發(fā)生與睡眠－覺醒機制相關(guān)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)生改變密切相關(guān)［7］。5-HT是公認的參與睡眠－覺醒機制的神經(jīng)遞質(zhì)，對慢波睡眠的發(fā)生和維持起重要作用，是腦內(nèi)的“致眠因子”［8］。5-HIAA是腦內(nèi)5-HT的代謝產(chǎn)物，其含量的增加表達了5-HT的合成和代謝的加強［9］，故腦內(nèi)5-HT遞質(zhì)及5-HIAA含量的變化是反映大鼠失眠發(fā)生的指標之一。PCPA是5-HT合成抑制劑，腹腔注射PCPA能造成睡眠晝夜節(jié)律消失，達到完全失眠，故PCPA失眠大鼠模型是目前公認的、廣泛地用于失眠癥中樞5-HT遞質(zhì)研究的經(jīng)典動物模型。中樞5-HT能神經(jīng)元胞體大部分位于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的中縫核群，其纖維投射到丘腦、下丘腦、海馬、基底神經(jīng)節(jié)和大腦皮層。海馬在睡眠－覺醒的調(diào)節(jié)中起重要作用［10］。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量較正常組大鼠顯著性降低，說明實驗PCPA失眠大鼠模型復制成功;而針刺失眠穴方、臍內(nèi)環(huán)針刺和二者結(jié)合針刺均顯示，有升高PCPA失眠大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量的作用，從而恢復PCPA所致失眠大鼠的睡眠－覺醒周期，提示該3種針法均對失眠癥有效;而二者結(jié)合針法顯示了明確的疊加作用，優(yōu)于2種單一方法，故本實驗支持其為失眠癥治療的優(yōu)選方法。

綜上，3種針法均可能通過升高海馬5-HT、5-HIAA含量起到治療失眠的作用，實驗支持針刺失眠穴方合臍內(nèi)環(huán)穴方法為失眠癥的優(yōu)選干預方法。

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Study of Three Aupuncture Methock on Affecting the Content of 5-HT，5-HIAA in Hippocampal of PCPA Insomnia Rats

LUO Ben-hua，WANG Yan，ZHANG Ya-fei，LUO Mei-gui

(Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China)

Objective:To observe the three acupuncture methods on affecting the content of 5-HT，5-HIAA in hippocampal of PCPA insomnia model rats of the acupuncture of umbilical inner acupoints，the acupoint-prescription of insomnia，their combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupointprescription，and to select the optimal acupuncture method.Methods:After being randomed，PCPA insomnia modeled，insomnia screened on the 70 male rats，the resulted 60 rats were randomly divided into six groups，and each group were 10.The normal group and the model group were given no special treatment，the three observation group were given acupuncture treatment of the umbilical inner acupoints，the acupoint-prescription of insomnia，their combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription respectively.The non-acupoint group was dealed with acupuncture non-acupoint.After six days of treatment，in the hippocampus homogenates of the rats，the content levels of 5-HT and 5-HIAA were detected by enzyme-linked immunoassay.Results:The contents of 5-HT，5-HIAA in hippocampal of PCPA insomnia model rats were significantly reduced.Three acupuncture methods can improve the 5-HT and 5-HIAA contents in hippocampal of rats.Their combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription displayed a better effective increasing the content of 5-HT，5-HIAA than each single method of acupuncture and showed an additive effect.Conclusion:Three acupuncture methods might take affect on insomnia by the mechanism of improving the contents of 5-HT and 5-HIAA in hippocampal.The experiment suggested that the combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription therefore was the preferred acupuncture.

Primary insomnia;The acupuncture of umbilical inner acupoints;The acupoint-prescription of insomnia; 5-HT(Serotonin);5-HIAA

R245.3

B

1006-3250(2016)11-1517-03

2016-05-20

廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA019133，桂財教［2013］19號)

羅本華(1968-)，男，湖南邵陽人，主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事中醫(yī)及壯醫(yī)針灸防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。