HPLC法同時(shí)測(cè)定三味龍膽花片中龍膽苦苷及獐牙菜苦苷

余繼英， 吳 亮， 徐傅能， 張靜波， 陳 瑾， 何 林*

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川成都610072；2.西南交通大學(xué)，四川成都610000；3.四川宇妥藏藥藥業(yè)有限公司，四川成都610000）

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HPLC法同時(shí)測(cè)定三味龍膽花片中龍膽苦苷及獐牙菜苦苷

余繼英1， 吳 亮2， 徐傅能2， 張靜波3， 陳 瑾1， 何 林1*

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川成都610072；2.西南交通大學(xué)，四川成都610000；3.四川宇妥藏藥藥業(yè)有限公司，四川成都610000）

摘要:目的 建立HPLC法同時(shí)測(cè)定三味龍膽花片（白花龍膽、甘草、蜂蜜）中龍膽苦苷及獐牙菜苦苷的含有量。方法 藥物甲醇提取液的分析采用Diamonsi1C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動(dòng)相為甲醇-水（25∶75）；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm。結(jié)果 龍膽苦苷和獐牙菜苦苷分別在20.1～201.0 ng（r=0.999 9）和19.76～197.6 ng（r=0.999 9）范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為99.93％ 和100.8％，RSD值分別為1.65％和2.06％。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于三味龍膽花片的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:三味龍膽花片；龍膽苦苷；獐牙菜苦苷；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.018

KEY W 0RDS: Sanwei Longdanhua Tab1ets；gentioPicroside；swertiamarin；HPLC

藏藥三味龍膽花片是由白花龍膽（即高山龍膽的干燥花）、甘草及蜂蜜所組成的復(fù)方制劑，具有清熱、潤(rùn)肺功能，主要用于治療肺熱氣喘、咽喉炎，但原標(biāo)準(zhǔn)僅有以龍膽苦苷為對(duì)照的薄層鑒別及甘草酸的含有量測(cè)定［1］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)處方組成并參考相關(guān)文獻(xiàn)［2-14］，建立了同時(shí)測(cè)定三味龍膽花片中龍膽苦苷及獐牙菜苦苷含有量的HPLC方法，以期更加全面地評(píng)價(jià)其質(zhì)量，并為進(jìn)一步研究提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 600高效液相色譜儀，配備Waters 717自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-10A檢測(cè)器、Waters EmPower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；Sartorius-BP211D分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

龍膽苦苷（批號(hào)110770-201013，純度96.9％）、獐牙菜苦苷（批號(hào)130514，純度98％）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。三味龍膽花片（四川宇妥藏藥藥業(yè)有限公司，批號(hào)140501、140701、140901）。甲醇為色譜純（美國(guó)Dikma公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) Dikma Diamonsi1C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃。理論塔板數(shù)按龍膽苦苷及獐牙菜苦苷色譜峰計(jì)算，均不低于3 000。龍膽苦苷及獐牙菜苦苷對(duì)照品、供試品及陰性樣品溶液的色譜圖見圖1。

A.對(duì)照品 B.供試品 C.陰性樣品1.獐牙菜苦苷 2.龍膽苦苷A.reference substances B.samP1es C.negative samP1e 1.swertiamarin 2.gentioPicroside圖1　三味龍膽花片HP L C色譜圖Flg.1 HPLC chromatograms of Sanwel Longdanhua Tablets

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取龍膽苦苷、獐牙菜苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.005 mg/mL和0.987 8 mg/mL的溶液，即得儲(chǔ)備液。再分別精密量取兩種貯備液適量，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得分別含龍膽苦苷和獐牙菜苦苷10.05 μg/mL和9.878 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取三味龍膽花片10片，除去薄膜衣，研細(xì)，精密稱取0.5 g，精密加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流15 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取5 mL置于離心管，4 000 r/min離心5 min，精密量取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液 按三味龍膽花片的處方和制法制備陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密吸取混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12、15、18、20 μL，注入色譜儀，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，見表1。

表1　兩種成分回歸方程Tab.1 Regresslon equatlons of two constltuents

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積為指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的RSD分別為0.2％、0.3％（n =6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD分別為1.86％、1.17％（n =6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液適量，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷峰面積的RSD分別為1.45％和1.11％，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率 精密稱取含有量已知的3味龍膽花片樣品粉末0.25 g，共9份，分別加入龍膽苦苷和獐牙菜苦苷儲(chǔ)備液適量，使其最終含有量約為樣品的80％、100％和120％，每個(gè)水平各3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests（n=9）

2.4 樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行3份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，外標(biāo)法計(jì)算兩組分含有量，結(jié)果見表3。

表3　樣品測(cè)定結(jié)果（±s，n=3）Tab.3 Determ lnatlon results of samp les（±s，n=3）

表3　樣品測(cè)定結(jié)果（±s，n=3）Tab.3 Determ lnatlon results of samp les（±s，n=3）

樣品批號(hào)　龍膽苦苷/（mg·g-1）　獐牙菜苦苷/（mg·g-1）140501　3.615±0.093　4.144±0.110 140701　2.876±0.067　3.768±0.051 140901　3.215±0.048　4.553±0.088

3 討論

根據(jù)制劑處方特點(diǎn)和指標(biāo)成分理化性質(zhì)，以不同比例甲醇（25％、50％、100％）為溶劑，考察了不同提取方法（超聲、加熱回流）和不同提取時(shí)間（15 min、30 min、1 h）的提取效率，同時(shí)以濾過(guò)和離心兩種方式處理供試液。結(jié)果，超聲提取效率較低，而加熱回流不同時(shí)間下的提取效率無(wú)顯著差異，另外提取物直接離心處理時(shí)的重復(fù)性更好，操作也更方便。

參照文獻(xiàn)，考察了甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)的分離效果，綜合考慮出峰時(shí)間、峰形等因素，最終選用流動(dòng)相為甲醇-水（25∶75）。

3批樣品指標(biāo)成分的含有量有一定差異，這可能由于原料產(chǎn)地、采收時(shí)間等因素的不同［15］。而且，對(duì)指標(biāo)成分進(jìn)行控制，有助于產(chǎn)品質(zhì)量的全面評(píng)價(jià)，并為進(jìn)一步的體內(nèi)研究打下基礎(chǔ)。

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Slmultaneous determ lnatlon of gentloplcroslde and swertlamarln ln Sanwel Longdanhua Tablets by HPLC

YU Ji-ying1， WU Liang2， XU Fu-neng2， ZHANG Jing-bo3， CHEN Jin1， HE Lin1*
（1.Sichuan Provincial Academy of Medical Sciences，DePartment of Pharmacy，Sichuan Provincial PeoPle' s HosPital，Chengdu 610072，China；2.Southwest Jiaotong University，Chengdu 610000，China；3.Sichuan Yutuo Tibetan Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chengdu 610000，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLCmethod for the simu1taneous determination of gentioPicroside and swertiamarin in Sanwei Longdanhua Tab1ets（Gentian algida，Glycyrrhiza uralensis and honey）by HPLC.METH 0 DS The ana1ysis of methano1ic extract of this drug was Performed on Diamonsi1C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm），with co1umn temPeraturemaintained at30℃，metho1-H2O（25∶75）asmobi1e Phase at a f1ow rate ofbook=319,ebook=971 mL/min and detection wave1ength set at 240 nm.RESULTS The 1inear ranges were 20.1 -201.0 ng （r=0.999 9）for gentioPicroside and 19.76 -197.6 ng（r=0.999 9）for swertiamarin，whose average recoveries were 99.93％ and 100.8％ with the RSDs of 1.65％ and 2.06％，resPective1y.C0NCLUSI0 N This simP1e and accuratemethod is re1iab1e for the qua1ity contro1of Sanwei Longdanhua Tab1ets.

*通信作者:何 林，男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事新制劑及其藥動(dòng)學(xué)研究。Te1:（028）87393932，E-mai1: he1inn@tom.com

作者簡(jiǎn)介:余繼英（1963—），女，碩士，主任藥師，從事藥物制劑質(zhì)量研究。Te1:（028）87393316，E-mai1: yujiying@163.com

基金項(xiàng)目:四川省科技支撐計(jì)劃（2012SZ0182）

收稿日期:2015-05-13

中圖分類號(hào):R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0318-04