九香蟲對染錳雄性大鼠生殖損傷的保護(hù)

何志全， 張 莉， 凌 蕾， 孫志誠， 侯曉暉

（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003）

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九香蟲對染錳雄性大鼠生殖損傷的保護(hù)

何志全， 張 莉， 凌 蕾， 孫志誠， 侯曉暉*

（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003）

摘要:目的 探討九香蟲對生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠生殖功能的保護(hù)作用。方法 將35只8周齡的雄性SD大鼠隨機(jī)均分為5組，即模型組、空白組和九香蟲高、中、低劑量干預(yù)組。除空白組外，其余大鼠給予腹腔注射15 mg/kg MnC12·4H2O建立生殖損傷模型，九香蟲組飼料含高、中、低劑量的九香蟲，連續(xù)8周。觀察和檢測SD大鼠的生殖能力指標(biāo)（性行為、大鼠精子數(shù)、睪丸和附睪的臟器系數(shù)、血清性激素水平）。結(jié)果 模型組的撲捉次數(shù)，射精能力，和精子數(shù)量較空白組和九香蟲中、低劑量干預(yù)組明顯下降；模型組睪丸、附睪臟器系數(shù)均顯著低于空白組和九香蟲高劑量干預(yù)組；模型組血清中睪酮水平均低于空白組和九香蟲干預(yù)組，而黃體生成素水平則高于空白組和九香蟲中劑量干預(yù)組。結(jié)論 中劑量的九香蟲對生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠生殖功能具有最佳保護(hù)功效果。

關(guān)鍵詞:九香蟲；錳染毒；生殖損傷；生殖保護(hù)

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.006

KEY W 0RDS: stik-bug（AsPongoPus chinensis）；exPosure to manganese；reProductive damage；reProductive Protection

九香蟲為昆蟲綱半翅目蝽科九香蟲（AsPongo-Pus chinensis）的干燥全蟲，主產(chǎn)于貴州、四川、云南等地，俗稱“屁板蟲”、“打屁蟲”、“屁巴蟲”。在民間，可作為中藥昆蟲和保健食品而廣泛食用，具有很高的藥用和食用價值，素有“有錢吃鹿茸，無錢吃打屁蟲”和“吃了屁巴蟲，滋補(bǔ)賽參茸，嚴(yán)冬不怕冷，夜間不尿床”等俗諺?！侗静菥V目》記載，該藥“氣味咸溫、無毒，主治膈脘滯氣、脾腎虧損、壯元陽”。《中國藥典》也記載其“歸肝脾腎經(jīng)，功能理氣止痛、溫中助陽，用于胃寒脹痛、脾胃氣痛、腎虛陽痿、腰膝酸痛”。研究證實(shí)［1-2］:九香蟲含有多種維持人體正常生理功能所必須的氨基酸、脂肪酸、維生素，微量元素（Fe、Zn）等營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗菌抑菌等藥理作用；其粗提物對于肝癌、胃癌細(xì)胞的體外生長亦有一定的抑制作用［3］；對治療遺精、陽痿、腎炎、胃痛、痛經(jīng)等有很好功效［4-9］。如此國藥瑰寶，若能通過現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)和方法證實(shí)其“溫中助陽”的功能，必將為其進(jìn)一步開發(fā)為藥品或保健品提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。迄今為止，國內(nèi)外對九香蟲用于生殖系統(tǒng)損傷保護(hù)方面的研究尚未見報道，因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了九香蟲干預(yù)生殖損傷實(shí)驗(yàn)，通過檢測大鼠精子數(shù)、睪丸和附睪的臟器系數(shù)、血清性激素水平等指標(biāo)反映九香蟲對生殖損傷的保護(hù)作用和功能水平改善，通過性行為觀察推斷九香蟲是否具有促進(jìn)“溫中助陽”功效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 清潔級SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g，雄性和雌性各35只，購于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室，許可證號: SCXK（渝）2012-0005。適養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 九香蟲若干（采自貴州省遵義市正安等縣），MnC12·4H2O（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），NaC1（分析純，上?；瘜W(xué)試劑總廠），總蛋白定量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3 飼料制備 九香蟲飼料的制備:將購于遵義醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心的普通飼料磨成粉后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％、10％、5％的九香蟲粉末，混勻，將其制成圓柱形，置于37℃烘箱中烘干，備用。

1.2 方法

1.2.1 染錳雄性大鼠生殖損傷模型建立 將35只雄性SD大鼠隨機(jī)分為模型組、空白組和九香蟲高、中、低劑量干預(yù)組，每組7只。通過腹腔注射15 mg/kg MnC12·4H2O，1次/d，每周5 d，連續(xù)8周，空白組同樣方式給予等量的生理鹽水，通過錳染毒制備生殖損傷模型［10］。

1.2.2 九香蟲干預(yù)實(shí)驗(yàn) 生殖損傷模型建立后第2周（即造模開始第9周）進(jìn)行了九香蟲干預(yù)實(shí)驗(yàn)，為保證每只大鼠的攝食量一致，采取單籠飼養(yǎng)，每日每只飼喂30 g飼料，九香蟲高、中、低劑量干預(yù)組分別給予含九香蟲20％、10％、5％的飼料喂養(yǎng)，模型組、空白組給予不含九香蟲的飼料喂養(yǎng)，1次/d，7 d/周，連續(xù)8周。

1.2.3 生殖能力指標(biāo)檢測

1.2.3.1 性行為觀察 發(fā)情雌鼠制備:通過手術(shù)方法，將35只雌性SD大鼠雙側(cè)卵巢切除，術(shù)后經(jīng)肌肉注射青霉素2 U/d，連續(xù)3 d。飼養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前48 h肌注苯甲酸雌二醇200 μg/kg，合籠前4 h肌注2 mg/kg黃體酮，以獲得發(fā)情良好的雌鼠。

性行為觀察:晚上7點(diǎn)開始觀察，將雄性SD大鼠放入紅色燈光下的透明盒10 min后，再將發(fā)情的雌鼠放入，觀察到大鼠間互相接觸、嗅舔、外生殖器探測等，之后出現(xiàn)撲捉和射精行為，每只雄性SD大鼠觀察15 min。記錄撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)以及射精次數(shù)。

1.2.3.2 睪丸和附睪臟器系數(shù) 處死大鼠，摘取睪丸，迅速剝?nèi)ブ車窘M織和結(jié)締組織后稱重，并按下列公式計(jì)算睪丸臟器系數(shù):睪丸臟器系數(shù)=（睪丸質(zhì)量/體質(zhì)量）×100％。附睪臟器系數(shù)計(jì)算方法同睪丸。

1.2.3.3 精子計(jì)數(shù)及每日精子生成量測定 精子計(jì)數(shù):取大鼠一側(cè)附睪，剪碎附睪尾，置于4 mL PBS緩沖液中，于37℃水浴箱中孵育15 min，制備精子混懸液，混勻，取出10 μL精子混懸液于另一盛有90 μL PBS的離心管中，混勻，取10 μL于血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下數(shù)出5個中方格的總精子數(shù)n，則每mL精液中含有的精子數(shù)為n× 25/5×稀釋倍數(shù)（10）×104。

每日精子生成量（dai1y sPerm Production，DSP）測定:取睪丸組織精確稱重，移至加少量睪丸勻漿液（STM）勻漿管，在內(nèi)切式組織勻漿器中勻漿，定容至25 mL。取10 μL勻漿液于血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下數(shù)出5個中方格的總精子數(shù)n。每克睪丸中精子頭數(shù)=n×25/5×STM稀釋系數(shù)（25）×104÷組織質(zhì)量；每日精子生成量=每克睪丸精子頭計(jì)數(shù)÷大鼠精子發(fā)生所需時間（6.1 d）。

1.2.3.4 血清中性激素測定 用ELISA法，按照試劑盒說明書的操作方法檢測各組雄性SD大鼠血清中的睪酮和黃體生成素。

2 結(jié)果

2.1 九香蟲對SD大鼠性行為的影響 表1顯示:空白組大鼠相對活躍，表現(xiàn)多動，興奮，而模型組則精神萎靡不振、少動，兩組之間的撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)以及射精次數(shù)有顯著性差異（P＜0.05），說明生殖系統(tǒng)損傷模型建立成功；九香蟲干預(yù)組與模型組比較，中、低劑量組大鼠撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)和射精次數(shù)明顯增多，差異顯著（P＜0.05），高劑量組的騎跨次數(shù)和插入次數(shù)明顯增多（P＜0.05），而撲捉次數(shù)和射精次數(shù)沒有顯著差異?？赏茢囡曃挂欢▌┝烤畔阆x對大鼠有改善性行為的功效，但過量飼喂九香蟲后改善功效出現(xiàn)下降趨勢。

表1　各組間大鼠性行為的比較（±s，n=7）Tab.1 Comparlson of rats sexual behavlor lnd lces（±s，n=7）

表1　各組間大鼠性行為的比較（±s，n=7）Tab.1 Comparlson of rats sexual behavlor lnd lces（±s，n=7）

注:與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別　　撲捉次數(shù)/次　　騎跨次數(shù)/次　　插入次數(shù)/次　　射精次數(shù)/次空白組81.67±13.32　38.33±5.51　32.00±1.73　30.00±3.46模型組　57.00±15.89*　20.60±4.04*　12.66±8.50*　14.42±8.22*九香蟲高劑量干預(yù)組　70.63±9.32　32.67±7.23△　28.00±7.00△　18.00±8.83九香蟲中劑量干預(yù)組　82.00±16.87△　33.80±8.58△　31.20±7.19△　28.00±9.31△九香蟲低劑量干預(yù)組　74.88±11.53△　33.00±8.99△　30.43±8.90△　29.00±6.16△

2.2 各組大鼠睪丸臟器系數(shù)、附睪臟器系數(shù) 表2顯示:模型組與空白組相比，臟器系數(shù)明顯下降，有顯著差異（P＜0.05），說明生殖系統(tǒng)損傷模型動物臟器發(fā)生了相應(yīng)的萎縮。但九香蟲干預(yù)后，與模型組比較，高劑量組大鼠體質(zhì)量及睪丸、附睪臟器系數(shù)顯著升高（P＜0.05），中劑量組體質(zhì)量及睪丸臟器系數(shù)顯著升高（P＜0.05），低劑量組睪丸臟器系數(shù)顯著升高（P＜0.05）?？赏茢嗑畔阆x對大鼠的臟器有一定的保護(hù)功能，且與九香蟲劑量有一定的正相關(guān)。

表2　各組大鼠睪丸臟器系數(shù)、附睪臟器系數(shù)的比較（x± s，n=7）Tab.2 Comparlson of rats testls organ coefflclent，epldldym ls（±s，n=7）

表2　各組大鼠睪丸臟器系數(shù)、附睪臟器系數(shù)的比較（x± s，n=7）Tab.2 Comparlson of rats testls organ coefflclent，epldldym ls（±s，n=7）

注:與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別　　體質(zhì)量/g 睪丸臟器系數(shù)　附睪臟器系數(shù)空白組431.60±32.31 0.95±0.05 0.39±0.11模型組　380.11±22.67*0.81±0.09*0.29±0.03*九香蟲高劑量干預(yù)組　423.10±52.08△0.96±0.04△　0.38±0.06△九香蟲中劑量干預(yù)組　422.29±23.14△0.95±0.12△0.34±0.03九香蟲低劑量干預(yù)組　407.74±28.43　 0.92±0.06△0.34±0.02

2.3 精子計(jì)數(shù)和每日精子生成量 表3顯示:模型組與空白組比較，精子數(shù)量和DSP都顯著下降（P＜0.05），說明生殖系統(tǒng)損傷模型大鼠精子發(fā)生出現(xiàn)了一定的障礙。九香蟲干預(yù)后，與模型組比較，中、高劑量組大鼠精子數(shù)量和DSP明顯增加（P＜0.05），低、中劑量組精子數(shù)顯著增加（P＜0.05）?？赏茢嗑畔阆x有助于精子發(fā)生，且與九香蟲劑量有一定的關(guān)聯(lián)。

表3　各組大鼠精子數(shù)量和每日精子生成量的比較（±s，n=7）Tab.3 Com parlson of rats sperm number and DSP（±s，n=7）

表3　各組大鼠精子數(shù)量和每日精子生成量的比較（±s，n=7）Tab.3 Com parlson of rats sperm number and DSP（±s，n=7）

注:與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別　　精子數(shù)/ （107·mL-1）精子頭計(jì)數(shù)/ （×106·g-1）每日精子生成量/ ［×106·（g·d）-1］2.47±0.50　 81.466±18.351　 13.355±3.008模型組　1.38±0.49*54.500±6.065*　8.934±0.994*九香蟲高劑量干預(yù)組1.91±0.56　 73.302±17.676△12.017±2.898△九香蟲中劑量干預(yù)組2.40±0.95△68.527±11.583△11.324±5.678△九香蟲低劑量干預(yù)組2.32±0.55△64.368±13.637　 10.552±空白組2.236

2.4 血清性激素睪酮(T)和黃體生成素(LH)的含有量測定結(jié)果 表4顯示:模型組與空白組相比，血清中的睪酮含有量降低，黃體生成素含有量升高，差異極顯著（P＜0.01），與已有報道一致。九香蟲干預(yù)組與模型組比較，血清中的睪酮水平升高，有顯著差異（P＜0.05）；中劑量組黃體生成素含有量下降，有顯著差異（P＜0.05），高、低

表4　各組大鼠血清睪酮和黃體生成素含有量測定結(jié)果的比較（±s，n=7）Tab.4 Com parlson of serum testosterone and lutelnlzlng rats results to determ lne plgment content（±s，n=7）

表4　各組大鼠血清睪酮和黃體生成素含有量測定結(jié)果的比較（±s，n=7）Tab.4 Com parlson of serum testosterone and lutelnlzlng rats results to determ lne plgment content（±s，n=7）

注:與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

組別　　睪酮/（ng·L-1）　黃體生成素/（ng·L-1）空白組98.17±3.49　19.39±1.21模型組　90.43±2.69**　23.56±1.60**九香蟲高劑量干預(yù)組　97.36±4.14△　20.82±2.43九香蟲中劑量干預(yù)組　97.27±3.31△　20.01±2.48△九香蟲低劑量干預(yù)組　97.08±4.33△21.94±0.96

劑量組無顯著差異。說明一定劑量的九香蟲有助于改善雄性大鼠的生精功能。

3 討論

近年來，隨著社會科技的發(fā)展、人們健康意識的加強(qiáng)及生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展，錳與生殖健康的關(guān)系越來越受到關(guān)注。研究證實(shí)［10-11］，錳暴露能引起包括生精細(xì)胞凋亡、睪丸生長發(fā)育與成熟延遲、精液濃度和精子活率降低、生精功能障礙等生殖系統(tǒng)損傷。而九香蟲在民間，可作為中藥昆蟲和保健食品而廣泛食用，具有很高的藥用和食用價值。研究也證實(shí)［1-2］，九香蟲含有多種維持人體正常生理功能所必須的氨基酸、脂肪酸、維生素，微量元素（Fe、Zn）等營養(yǎng)物質(zhì)，是人體所需的重要營養(yǎng)成分，具有抗菌抑菌等藥理作用；其粗提物對于肝癌、胃癌細(xì)胞的體外生長亦有一定的抑制作用［3］，但對生殖系統(tǒng)損傷的生殖功能是否具有保護(hù)作用仍未得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)從動物的性行為、大鼠精子數(shù)、睪丸和附睪的臟器系數(shù)、血清性激素水平等生殖能力指標(biāo)來分析判斷九香蟲對生殖系統(tǒng)的保護(hù)功效。

本研究結(jié)果可知:九香蟲干預(yù)生殖系統(tǒng)損傷的動物模型后，其大鼠相對活躍，表現(xiàn)多動，興奮，與模型組相比，中、低劑量組的撲捉次數(shù)、騎跨次數(shù)、插入次數(shù)以及射精次數(shù)明顯增多（P＜0.05），其表現(xiàn)接近于空白組。可推斷九香蟲有改善大鼠性行為的功效。臟器系數(shù)是指實(shí)驗(yàn)動物某臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量之比值。正常時各臟器與體質(zhì)量的比值相對恒定，但動物染毒后隨受損臟器質(zhì)量改變臟器系數(shù)也發(fā)生改變。因此，臟器系數(shù)的變化可反映在環(huán)境因素影響下臟器的增生、充血、水腫或萎縮等變化，是毒理實(shí)驗(yàn)中常用的指標(biāo)。表2結(jié)果顯示:九香蟲干預(yù)后，高劑量組的體質(zhì)量及睪丸、附睪臟器系數(shù)均高于模型組（P＜0.05）。可推斷九香蟲對大鼠的臟器有一定的保護(hù)功能，且與九香蟲劑量有一定的正相關(guān)。精子數(shù)量和DSP是研究環(huán)境因素對男（雄）性生殖健康影響的重要觀察點(diǎn)之一，可有效判斷生殖毒性。表3顯示:九香蟲干預(yù)后，與模型組比較，低、中劑量組的精子數(shù)明顯增加（P＜0.05），中、高劑量組的精子頭數(shù)和DSP明顯增加（P＜0.05）?？赏茢嗑畔阆x有利于改善生精環(huán)境，有助于精子發(fā)生，且與九香蟲劑量有一定的關(guān)聯(lián)。血清中性激素水平是評價精子發(fā)生，了解睪丸組織結(jié)構(gòu)特征的重要指標(biāo)，可反映睪丸的生精功能。研究證實(shí)［12-13］:染錳可引起雄性動物血清中的睪酮含有量降低，黃體生成素含有量升高。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明:模型組與空白組相比，血清中的睪酮含有量降低，黃體生成素含有量升高，差異極顯著（P＜0.01），與已有報道一致。九香蟲干預(yù)后，與模型組比較，血清中的睪酮含有量明顯升高（P＜0.05）；中劑量組的黃體生成素明顯下降（P＜0.05）?？赏茢嗑畔阆x有助于改善激素調(diào)控水平，增強(qiáng)雄性大鼠的生精功能。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時也顯示，部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出現(xiàn)高劑量組的保護(hù)效果不如低、中劑量組明顯的現(xiàn)象，可能是高劑量并非最佳的給藥劑量，九香蟲劑量過多其保護(hù)作用可能下降。因此，善需進(jìn)一步摸索九香蟲的最佳保護(hù)劑量。

綜上所述，九香蟲干預(yù)生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠后，其各項(xiàng)生殖能力指標(biāo)均有較明顯的改善，說明九香蟲對生殖系統(tǒng)損傷的雄性大鼠生殖功能具有保護(hù)功效，且保護(hù)效果多以九香蟲高、中劑量干預(yù)組效果最佳，但其保護(hù)的作用機(jī)制仍不清楚，還有待下一步繼續(xù)研究。

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［臨 床］

Protectlon of stlnk-bug on manganese-lnduced reproductlve damage to male rats

HE Zhi-quan， ZHANG Li， LIN Lei， SUN Zhi-cheng， HOU Xiao-hui*
（ZunyiMedical College，Zunyi563003，China）

ABSTRACT:AIM To investigate the Protective effect of stink-bug（AsPongoPus chinensis）on the manganeseinduced reProductive damages toma1e rats.METH0DS Thirty-fivema1e eightweeks o1d SD ratswere random1y divided into five grouPs（n =7）: the mode1grouP，the b1ank grouP and stink-bug high-，medium-and 1ow-dose intervention grouPs.ExcePt the b1ank grouP，the rest of rats received intraPeritonea11y MnC12·4H2O（15 mg/kg）to create reProductive damaged mode1 rats.Stink-bug grouPswere fed on the fodderwith stink-bug for eightweeks. The rats' reProductive caPacity indices，inc1uding sexy activity，sPerm count，the organ coefficientof testis and eP-ididymis，and serum sex hormone 1eve1weremeasured.RESULTS ComPared with the b1ank grouP and stink-bug medium-and 1ow-dose grouPs，sexua1 behavior indexes inc1uding caPturing times，ejacu1ation abi1ity，and sPerm count in themode1grouP were 1ower；comPared with the b1ank grouP and stink-bug high dose grouP，the coefficient of testis and ePididymis viscera in themode1grouP was a1so 1ower.The serum testosterone 1eve1s in themode1grouP were 1ower than those of the b1ank grouP and stink-bug grouPs（P＜0.05）.But1uteinizing hormone 1eve1was higher than that of the b1ank grouP and stink-bugmedium grouP.C0NCLUSI0N Themedium-dose stink-bug is the best choice in terms of rePairing the reProductive damages ofma1e rats.

*通信作者:侯曉暉（1980—），女，博士，教授，主要從事生物學(xué)研究。E-mai1: 330539793@qq.com

作者簡介:何志全（1979—），男（瑤族），碩士，副教授，主要從事生殖發(fā)育研究。E-mai1: 17563239@qq.com

基金項(xiàng)目:貴州省“125計(jì)劃”重大科技專項(xiàng)（黔教合重大專項(xiàng)字［2014］031）；貴州省中醫(yī)藥管理局基金（QZYY2011-65）；貴州省級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201413653018）

收稿日期:2015-3-03

中圖分類號:R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0258-04