紫草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎毒性和血管抑制作用

何育霖， 楊雨婷， 何貝軒， 李玉芝， 曹治興， 彭 成

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137）

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紫草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎毒性和血管抑制作用

何育霖， 楊雨婷， 何貝軒， 李玉芝， 曹治興*， 彭 成*

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137）

摘要:目的 評(píng)價(jià)紫草素（shikonin）對(duì)斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育毒性及其血管抑制作用。方法 將受精后0、10、24、48 h （hours Post ferti1ization，hPf）發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎分別置于含有不同劑量紫草素的胚胎培養(yǎng)液中12、24、36、48 h后，顯微鏡下觀察紫草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的畸形率、死亡率、心率和血管生成的影響。結(jié)果 給藥24 h后，紫草素對(duì)不同發(fā)育階段斑馬魚(yú)的LD50在0.73～1.56 mg/L之間。給藥48 h后，該LD50值在0.25～0.39 mg/L之間。在給藥大于0.5 mg/L時(shí)，紫草素能在12 h內(nèi)引起斑馬魚(yú)的發(fā)育畸形，分別在1 h和24 h內(nèi)均能引起斑馬魚(yú)心率衰減（P＜0.01），在12 h內(nèi)可以顯著抑制斑馬魚(yú)正常血管的生長(zhǎng)。結(jié)論 紫草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育具有毒性，并對(duì)斑馬魚(yú)血管生成具有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞:紫草素；斑馬魚(yú)；胚胎；毒性；血管生成

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.003

KEY W 0RDS: shikonin；zebrafish；embryos；toxicity；angiogenesis

紫草為紫草科（Boraginaceae）多年生草本植物，中醫(yī)認(rèn)為紫草味苦、性寒，有涼血、活血、解毒和透疹等功能，長(zhǎng)期用于瘡瘍、淋濁、熱癥等［1］。紫草素（shikonin）是從中國(guó)傳統(tǒng)中藥材—紫草的根中含量最高的一種萘醌類(lèi)化合物（圖1），大量研究已證實(shí)其良好的抗腫瘤［2-3］、抗炎［4-5］、抗血管生成［6-7］等藥理作用。但目前對(duì)紫草素毒性方面研究的相關(guān)報(bào)道較少。

斑馬魚(yú)屬脊椎動(dòng)物，是一種新型模式動(dòng)物。斑馬魚(yú)個(gè)體小、發(fā)育快，其主要組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能、基因結(jié)構(gòu)和功能、基因調(diào)控途徑以及疾病特征等都與人類(lèi)相似［8］。斑馬魚(yú)遺傳背景清晰，對(duì)有害物質(zhì)非常敏感，對(duì)藥物反應(yīng)與人臨床反應(yīng)相似。已有大量實(shí)驗(yàn)研究證明斑馬魚(yú)非常適用于中藥多種人類(lèi)重大疾病治療的藥理學(xué)和毒理學(xué)研究［9-10］。斑馬魚(yú)的血管生成過(guò)程與哺乳動(dòng)物相似，從主動(dòng)脈分出的節(jié)間血管從受精后24 h（hours Post ferti1ization，hPf）發(fā)育生長(zhǎng)，48 hPf發(fā)育基本完全。因此，本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚(yú)胚胎為模型，旨在探究紫草素對(duì)斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的毒性并探討紫草素對(duì)斑馬魚(yú)正常血管的影響，為紫草素的深入研究提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與儀器 紫草素購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司（批號(hào)MUST-74072310），經(jīng)HPLC鑒定，純度＞98.6％。先用二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma-A1drich公司）溶解為母液，再用斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)劑量；斑馬魚(yú)拍照時(shí)用固定液（4％甲基纖維素溶于培養(yǎng)液中）固定。斑馬魚(yú)繁育與養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛(ài)生科技公司）；Axio Observer A1熒光倒置顯微成像系統(tǒng)（德國(guó)Zeiss公司）；M165-FC體式熒光顯微成像系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；AL104電子天平（瑞士Mett1er To1ed公司）。

1.2 斑馬魚(yú)飼養(yǎng)和繁育條件 無(wú)病原體［血管綠色熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因Tg（f1k1∶GFP），AB品系］斑馬魚(yú)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)培養(yǎng)繁殖。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)于全封閉循環(huán)系統(tǒng)，養(yǎng)殖和繁殖均參照zebrafish book［11］標(biāo)準(zhǔn)，斑馬魚(yú)房?jī)?nèi)光照/黑暗比為14 h/10 h，室內(nèi)溫度26℃，水溫28℃，PH 7.2～7.5，電導(dǎo)率500～550 μs/cm，其各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)均合要求。繁育前，將雌雄以1∶1數(shù)量移入產(chǎn)卵盒，并用隔板將雌雄分開(kāi)，次日清晨移去隔板雄魚(yú)追逐雌魚(yú)后30 min便可收集胚胎。胚胎用培養(yǎng)液清洗干凈移入無(wú)菌培養(yǎng)皿后，置于恒溫培養(yǎng)箱中。

1.3 紫草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎致死率和致畸率的測(cè)定選擇發(fā)育正常的0、10、24、48 hPf胚胎期斑馬魚(yú)隨機(jī)放入24孔板中，每孔10枚胚胎，每組50枚。將紫草素母液稀釋至以下劑量組: 3、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.0、0.75、0.5、0.25 mg/L，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和0.1％ DMSO組。吸取原培養(yǎng)液，按組分別加入1 500 μL含藥工作液，于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，每12 h觀察1次，繼之用胚胎培養(yǎng)液潤(rùn)洗，然后將斑馬魚(yú)胚胎放至具有凹槽的載玻片上，4％甲基纖維素固定，體視顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)胚胎死亡率、畸形率，并進(jìn)行拍照。

1.4 斑馬魚(yú)心率及心臟形態(tài)的測(cè)定 選擇發(fā)育正常的24 hPf、48 hPf胚胎期斑馬魚(yú)隨機(jī)放24孔板中，每孔10枚，即每組50枚胚胎。設(shè)空白對(duì)照組和紫草素試藥組（3、1.5、1.0、0.75、0.5 mg/L），按組分別在孔內(nèi)加入1 500 μL各工作液，于恒溫箱中培育，24 hPf胚胎期在給藥24 h后觀察，48 hPf胚胎期給藥組在給藥1 h后進(jìn)行觀察，在顯微鏡下用計(jì)時(shí)器計(jì)數(shù)各組胚胎在60 s內(nèi)的心跳次數(shù)。

1.5 斑馬魚(yú)體節(jié)間血管熒光觀察 選擇發(fā)育正常的24 hPf的胚胎期斑馬魚(yú)（FLk-eGFP），隨機(jī)放入24孔板中，每孔10枚，每組50枚。設(shè)空白對(duì)照組和紫草素試藥組（3、1.5、1.0、0.75、0.5 mg/L），按組分別在孔內(nèi)加入1 500 μL各工作液，并放入恒溫箱中培養(yǎng)。在藥物作用12 h后，在體式熒光顯微鏡下觀察熒光血管的生長(zhǎng)情況，并利用成像系統(tǒng)拍攝照片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件和Origin 75軟件進(jìn)行分析，死亡率、心率的試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)斑馬魚(yú)死亡率的影響 紫草素對(duì)各個(gè)發(fā)育階段的斑馬魚(yú)均具有致死性，對(duì)發(fā)育階段越早的胚胎其毒性越大，各組胚胎的死亡率隨給藥劑量和時(shí)間的增加而增加。紫草素作用于0、10、24、48 hPf胚胎12、24、36、48 h的LD50如表1所示。由表1可知，紫草素作用于早期發(fā)育階段的胚胎，隨時(shí)間的增加毒性增加。

表1　紫草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎LD5 0（±s，n=5）Tab.1 Effects of shlkonln on LD50of zebraflsh embryo （±s，n=5）

表1　紫草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎LD5 0（±s，n=5）Tab.1 Effects of shlkonln on LD50of zebraflsh embryo （±s，n=5）

發(fā)育時(shí)間點(diǎn)/h給藥后不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)LD50/（mg·L-1）0 hPf　 10 hPf　 24 hPf　 48 hPf 12　 1.25±0.03 1.51±0.12 1.56±0.13　 3.02±0.15 24　 0.85±0.04 0.73±0.11 0.94±0.14　 1.56±0.24 36　 0.21±0.01 0.52±0.08 0.63±0.50　 0.92±0.12 48　 0.25±0.04 0.28±0.03 0.32±0.06　 0.39±0.16

2.2 紫草素對(duì)斑馬魚(yú)畸形率的影響 紫草素可導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育畸形。紫草素作用于10 hPf胚胎期斑馬魚(yú)12 h后，結(jié)果顯示，0.5 mg/L紫草素組胚胎發(fā)育延遲，眼點(diǎn)渾濁，0.75 mg/L紫草素組胚胎節(jié)數(shù)與空白對(duì)照組相比減少，1.0 mg/L紫草素組胚胎發(fā)育非常遲緩，眼點(diǎn)、脊柱、尾部均未發(fā)育（圖1A～D）。紫草素作用于24 hPf胚胎24 h后，結(jié)果顯示，給藥組身體彎曲，尾部畸形，節(jié)數(shù)變短，黑色素明顯減少（圖1E～G）。紫草素作用于10 hPf、24 hPf胚胎期斑馬魚(yú)后不同時(shí)間測(cè)定的畸形率結(jié)果見(jiàn)圖2～3。紫草素各劑量組的畸形率與空白對(duì)照組相比，均具有顯著性差異，且隨著時(shí)間的增加其致畸性越強(qiáng)。

圖1　1 0 h p f（A～D）和2 4 h p f（E～G）加藥后紫草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響Flg.1 Effect of shlkon ln concentratlons on the developmental zebraflsh embryos adm lnlstratlng for 10 hp f（A～D）and 24 hpf（E～G）

圖2　紫草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎畸形率的影響（1 0 h p f）Flg.2 Effect of shlkonln on rate of teratogeny to zebraflsh embryos development adm lnlstratlng for 10 hpf

圖3　紫草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎畸形率的影響（2 4 h p f）Flg.3 Effect of shlkonln on rate of teratogeny to zebraflsh embryos development adm lnlstratlng for 24 hpf

2.3 紫草素對(duì)斑馬魚(yú)心率的影響 紫草素作用于24 hPf胚胎期斑馬魚(yú)24 h后，0.5 mg/L紫草素組斑馬魚(yú)心率與空白對(duì)照組相比降低（P＜0.05），0.75 mg/L和1 mg/L紫草素組斑馬魚(yú)心率與空白對(duì)照組相比均下降（P＜0.01），且具有劑量依賴(lài)性。紫草素作用于48 hPf胚胎期斑馬魚(yú)1 h后，0.5 mg/L紫草素組斑馬魚(yú)心率與空白對(duì)照組相比降低（P＜0.05），1.5 mg/L和3 mg/L紫草素組斑馬魚(yú)心率明顯降低，具有心臟急性毒性，與空白對(duì)照組相比差異均有顯著性（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2～3。

表2　紫草素對(duì)2 4 h p f斑馬魚(yú)胚胎心率的影響（±s，n=5）Tab.2 Effect of sh lkonln on the heart rate of zebraflsh embryos adm lnlstratlng for 24 hpf（±s，n=5）

表2　紫草素對(duì)2 4 h p f斑馬魚(yú)胚胎心率的影響（±s，n=5）Tab.2 Effect of sh lkonln on the heart rate of zebraflsh embryos adm lnlstratlng for 24 hpf（±s，n=5）

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

紫草素/（mg·L-1）　　心率/s-10 146.5±2.21 0.5　134.5±1.26*0.75　90.0±1.50**1 60.0±1.41**

表3　紫草素對(duì)4 8 h p f斑馬魚(yú)胚胎心率的影響（±s，n=5）Tab.3 Effect of shlkonln on the heart rate of zebraflshembryos adm ln lstratlng for 48 hp f（±s，n=5）

表3　紫草素對(duì)4 8 h p f斑馬魚(yú)胚胎心率的影響（±s，n=5）Tab.3 Effect of shlkonln on the heart rate of zebraflshembryos adm ln lstratlng for 48 hp f（±s，n=5）

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

紫草素/（mg·L-1）　　心率/s-10 142.0±2.41 0.5　139.0±1.29*1.5　95.5±0.96**3 49.5±1.26**

2.4 紫草素對(duì)斑馬魚(yú)血管生成的影響 紫草素作用于24 hPf胚胎期斑馬魚(yú)12 h后，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，紫草素各劑量組體節(jié)間血管長(zhǎng)度有顯著性差異，且呈劑量依賴(lài)性抑制（圖中紅色箭頭表明節(jié)間血管受到抑制），隨著劑量的增加，毒性也隨之增加。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　紫草素對(duì)2 4 h p f斑馬魚(yú)胚胎節(jié)間血管生成的影響Flg.4 Effect of shlkonln on the anglogenesls of zebraflsh embryos adm lnlstratlng for 24 hp f

3 討論

紫草素是紫草內(nèi)最主要的有效成分，《中國(guó)藥典》2010版將紫草素作為中藥紫草的含量和質(zhì)量測(cè)定指標(biāo)［12］。傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)將紫草作為外用藥物，用于治療溫病血熱毒勝、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等多種外傷和皮膚病，歷史上許多醫(yī)家多認(rèn)為紫草無(wú)毒或低毒，如《別錄》中記載“無(wú)毒”［1］，可能是因?yàn)樗幬锿庥煤?，紫草素進(jìn)入體內(nèi)的量非常少，不會(huì)達(dá)到有毒濃度。

現(xiàn)代藥理研究表明紫草素具有抗腫瘤、抗炎、抗血管生成等多種藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛［13］。但在研究上述新作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其具有較高的長(zhǎng)期毒性和急性毒性［14-15］。因此，本實(shí)驗(yàn)研究紫草素對(duì)各發(fā)育期斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育、心率和血管的影響。結(jié)果表明，紫草素＞0.5 μg/mL時(shí)即可導(dǎo)致各個(gè)發(fā)育階段的斑馬魚(yú)畸形，并在作用時(shí)間大于24 h后，表現(xiàn)出顯著增高的死亡率。

心率是體現(xiàn)心臟功能的一個(gè)重要指標(biāo)，斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育48 h后心率即趨于穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫草素不但在長(zhǎng)時(shí)間作用下能導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎心率明顯降低，而且在作用1 h的短時(shí)間內(nèi)即可導(dǎo)致斑馬魚(yú)心率迅速減慢，表現(xiàn)出顯著的急性心臟毒性。

血管新生是指在原有血管的基礎(chǔ)上形成新的血管，涉及內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、基底膜降解、血管官腔形成等一系列復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程［7］。研究表明，血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，切斷腫瘤組織從血管中獲得營(yíng)養(yǎng)途徑已經(jīng)成為新的腫瘤治療靶點(diǎn)［16］。已有研究發(fā)現(xiàn)紫草素具有抗血管生成的作用，是治療腫瘤的前景藥物［6-7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，紫草素能夠顯著抑制斑馬魚(yú)胚胎體節(jié)間血管生成，且呈劑量依賴(lài)性，伴隨毒性的產(chǎn)生。

綜上所述，紫草素對(duì)各個(gè)發(fā)育階段的斑馬魚(yú)具有全身多個(gè)器官的毒性，可能正因如此，使其在新藥研發(fā)研究中存在局限性。因此，以紫草素為先導(dǎo)，將結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造以降低其毒性，提高其選擇性是目前亟待解決的問(wèn)題和研究熱點(diǎn)。

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Effects of shlkonln on zebraflsh's embryo and anglogenesls

HE Yu-1in， YANG Yu-ting， HE Bei-xuan， LIYu-zhi， CAO Zhi-xing*， PENG Cheng*
（DeveloPment and Utilization of Chinese Medicine Resources，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China）

ABSTRACT:AIM To eva1uate shikonin on the deve1oPmenta1 toxicity and vascu1ar inhibition of zebrafish embryos.METH0DS Post ferti1ization embryos of zebrafish were exPosed to shikonin at a series concentrations for 0，10，24，or 48 hours.The inf1uence of shikonin on the embryos deve1oPment and angiogenesis of zebrafish was observed with microscoPe；their embryo deformity rate，morta1ity rate and heart ratewere a1so ana1yzed.RESULTS After treating for 24 h，the LD50of shikonin on the embryo at the deve1oPmenta1stages ranged from 0.73 -1.56 mg/L.After treating for48 h，the LD50of shikonin ranged from 0.25 -0.39 mg/L.When treated at concentrations greater than 0.5 mg/L，shikonin caused the embryo deformity in 12 h；decreased its heart beat in 1 and 24 h （P＜0.01）；inhibited the vesse1growth of zebrafish in 12 h.C0NCLUSI0N Shikonin has the toxic effects on the deve1oPment of zebrafish embryos and the growth inhibitory effects on zebrafish's angiogenesis.

*通信作者:曹治興（1984—），男，博士，助理研究員，主要從事中藥藥理與毒理研究。Te1:（028）61800234，E-mai1: caozhixing007 @163.com 彭 成（1964—），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理與毒理研究。Te1:（028）61800005，E-mai1: Pengchengchengdu@126.com

作者簡(jiǎn)介:何育霖（1995—），女，主要從事中藥藥理學(xué)研究。Te1: 18380445395，E-mai1: hy119951205@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金（81300437）

收稿日期:2015-06-15

中圖分類(lèi)號(hào):R966

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0241-05