甲狀腺腫瘤與循環(huán)RNA研究進展

肖海鵬，喻 爽

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510080

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甲狀腺腫瘤與循環(huán)RNA研究進展

肖海鵬，喻 爽

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510080

［摘要］甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，外周血循環(huán)RNA含量在多種惡性腫瘤患者血清中特異性表達，是潛在的腫瘤診斷的生物學(xué)標(biāo)志和藥物治療靶點。血清甲狀腺特異mRNA（包括促甲狀腺受體mRNA和甲狀腺球蛋白mRNA）被報道在甲狀腺腫瘤患者中異常表達，可以作為腫瘤診斷及其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。近年研究顯示，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在細菌、真菌和哺乳動物等多種生物體的活動中可作為癌基因或抑癌基因，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮調(diào)控作用，并且在循環(huán)血中穩(wěn)定存在，ncRNA有希望成為腫瘤診斷的新型無創(chuàng)標(biāo)志物。該研究介紹與甲狀腺腫瘤相關(guān)的循環(huán)RNA最新研究進展，并著重討論循環(huán)mRNA、微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding，lncRNA）及環(huán)狀RNA（circRNA）在甲狀腺腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移中的作用。

［關(guān)鍵詞］甲狀腺腫瘤；循環(huán)RNA；信使 RNA；非編碼RNA

肖海鵬，醫(yī)學(xué)博士、教授、博士生導(dǎo)師，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院院長、黨委書記，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科學(xué)科帶頭人、首席專家?，F(xiàn)任中國醫(yī)師協(xié)會內(nèi)分泌代謝科分會副會長、甲狀腺疾病學(xué)組主任委員，中國醫(yī)師協(xié)會全國醫(yī)師定期考核內(nèi)分泌專業(yè)編委會副主任委員，廣東省醫(yī)師協(xié)會內(nèi)分泌科醫(yī)師分會主任委員，廣東省醫(yī)師協(xié)會第三屆理事會常務(wù)理事，中華醫(yī)學(xué)會廣東省內(nèi)分泌學(xué)會副主任委員，美國甲狀腺學(xué)會（ATA）委員，美國內(nèi)分泌學(xué)會繼續(xù)教育委員會（CME）委員，歐洲醫(yī)學(xué)教育聯(lián)盟（AMEE）委員。同時擔(dān)任SCI 學(xué)術(shù)期刊Cardiovascular Endocrinology審稿專家，《中華醫(yī)學(xué)雜志》《中華內(nèi)分泌代謝雜志》《中國糖尿病學(xué)雜志》及《中華健康管理學(xué)雜志》等多家國內(nèi)核心期刊的編委和特約審稿專家。主持和參與“循環(huán)microRNA和甲狀腺癌”及“甲狀腺疾病診治”等多項國家自然科學(xué)基金和廣東省科技計劃課題。近5年，以第一或通信作者在JACC、JCEM等權(quán)威雜志發(fā)表SCI文章10余篇，參與編寫著作10余部。其領(lǐng)導(dǎo)的團隊在甲狀腺腫瘤的診治和機制方面研究達國際先進水平，例如首次報道了血清miRNA鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的診斷價值，提出miRNA的差異表達與BRAF基因突變相互作用于甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展，深入探討miR-20b、miR-218-2與甲狀腺腫瘤的發(fā)生的機制等，這些創(chuàng)新性的研究使該課題組在甲狀腺腫瘤分子標(biāo)志物的研究方面處于國內(nèi)外領(lǐng)先地位。

Circulating RNA in thyroid cancer

XIAO Haipeng, YU Shuang
（Department of Endocrinology, the First A ffi liated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China）

Correspondence to:XIAO Haipeng E-mail:xiaohp@mail.sysu.edu.cn

［Abstract］Thyroid cancer is the most common endocrine gland malignanct tumor.Numerous studies have found that the content of peripheral blood circulating RNA in various cancer types is aberrantly expressed, which couldbe a potential biological diagnostic marker and therapeutic target.Tissue-speci fi c messenger RNA has a dysregulated expression and may be used for the diagnosis and residual/metastatic detection of thyroid cancer.Recent studies have showed that non-coding RNA（ncRNA）could act as oncogene or tumor suppressor gene in bacteria, fungi and mammals.It plays a regulatory role in occurrence and development of tumors and stably exists in peripheral blood.It is hopeful that it will become a new marker for diagnosis of tumors.This review introduces some latest research progress on circulating RNA associated with thyroid cancer; and emphatically discuss the role of mRNA, microRNA（miRNA）, long non-coding RNA（lncRNA）and circular RNA（circRNA）in thyroid tumorigenesis and metastasis

［Key words］Thyroid tumor; Circulating RNA; mRNA; Non-coding RNA

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的腫瘤，其發(fā)病率占全身惡性腫瘤的2%，占內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤的95%［1］。2015年美國甲狀腺協(xié)會（American Thyroid Association，ATA）指南指出甲狀腺癌呈逐年上升趨勢，每年新診斷的甲狀腺癌由2009年的37 200例增長至2014年的63 000例，發(fā)病率由1975年的4.9/10萬增長到2009年的14.3/10萬，其中甲狀腺癌的增長幾乎均由甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）的發(fā)生率增加所致［2］。甲狀腺乳頭狀癌屬于分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC），約占所有甲狀腺癌的90%。PTC生長緩慢，預(yù)后良好；然而，由于其發(fā)病率及復(fù)發(fā)率（20%～40%）高，死亡率占甲狀腺癌總死亡率的50%以上［3］。此外，至2019年，PTC將成為女性的第三大腫瘤，其國家醫(yī)療支出將達190億～210億美元，給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)［2］。

目前對于甲狀腺腫瘤鑒別診斷常見方法包括臨床檢查、甲狀腺核素掃描、甲狀腺B超和細針抽吸活檢（fine needle aspiration，F(xiàn)NA）等［4］。其中FNA是最重要的檢查項目，但是FNA僅能進行細胞學(xué)檢查，而且這項技術(shù)與穿刺者的經(jīng)驗以及標(biāo)本量直接相關(guān)，可漏診1/3的甲狀腺惡性腫瘤，其中包括甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺濾泡狀腺瘤的鑒別，給臨床的診斷和治療帶來了不利［5］。再者，F(xiàn)NA為有創(chuàng)檢查，患者接受程度較低，故存在較大的局限性，臨床迫切需要尋找一種新的無創(chuàng)診斷生物學(xué)標(biāo)志物。

隨著對腫瘤相關(guān)基因研究的深入，目前人們對PTC發(fā)病的分子機制有了進一步認識。研究表明，BRAF基因、RAS基因的突變及RET/PTC基因重排與PTC的發(fā)生及其侵襲性等均存在不同程度的相關(guān)性［6］，其中BRAF基因突變與PTC關(guān)系最為密切。BRAFV600E突變與PTC的多灶性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及較高的臨床病理分期密切相關(guān)，從而預(yù)示較差的腫瘤預(yù)后［7-8］。然而，由于該基因突變僅存在于40%～45%的PTC患者中［7］，其作為診斷及預(yù)后標(biāo)志具有一定的局限性。此外，由于利用組織樣本進行分子生物學(xué)檢測也存在著一定的局限性，如標(biāo)本來源的限制、無法連續(xù)檢測及隨訪等，因此腫瘤患者外周血核酸分子檢測成為醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注的熱點。

1 腫瘤循環(huán) RNA

血漿、血清中游離RNA的發(fā)現(xiàn)是科學(xué)發(fā)展史上的一個重大突破。傳統(tǒng)觀念一直認為，游離RNA不可能穩(wěn)定存在于血漿、血清中，因為RNA本身極不穩(wěn)定且血液循環(huán)中存在的大量核酸酶也會影響其穩(wěn)定性。直到20世紀80年代末，幾篇報道清楚地闡明了可擴增的循環(huán)RNA的存在［9-10］，并且?guī)讉€研究小組檢測到惡性黑素瘤、乳腺癌和肺癌患者的血清中和腫瘤相關(guān)RNA［11-13］。在此研究的基礎(chǔ)上，2000年P(guān)oon等［14］在孕男胎的孕婦血漿中發(fā)現(xiàn)了Y染色體特異性鋅指蛋白（Y chromosome specific zinc finger protein，ZFY）mRNA，自此開辟了孕婦血漿血清中游離RNA的研究，也進一步證實循環(huán)RNA的存在。

目前對于腫瘤RNA在循環(huán)血中能穩(wěn)定存在及來源還未完全闡明，有研究指出血漿RNA可以通過與DNA形成雜交體而免受Rnase的降解。El-Hefnawy等［15］通過實驗發(fā)現(xiàn)Rnase-H對于RNA的回收無效，但是Rnase-H可以降解RNA-DNA雜交體，所以推測雜交體這種假說不是保護RNA免遭RNase降解的機制；另一方面El-Hefnawy等［15］的研究提示，內(nèi)源性RNA在體內(nèi)能穩(wěn)定存在數(shù)小時，推測可能由于循環(huán)RNA與脂質(zhì)結(jié)合，形成囊泡或脂蛋白，防止核糖核酸酶降解。既往研究推測循環(huán)RNA的來源包括被動過程和主動過程，被動過程即腫瘤細胞壞死后游離RNA進入循環(huán)血中；主動過程指循環(huán)RNA通過以凋亡小體或者微粒體形式從細胞中釋放。García等［16］的研究提示，在不同的疾病中，不同的RNA從囊泡中釋放至循環(huán)血中，并且推測RNA的富集與其特定的序列有關(guān)。Bolukbasi等［17］發(fā)現(xiàn)在惡性膠質(zhì)細胞瘤中，被富集的RNA均有一長度為25 bp的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其具有miR-1289和CTGCC序列結(jié)合位點，并發(fā)現(xiàn)該囊泡的形成與miR-1289在細胞中表達水平相關(guān)。

2 循環(huán)mRNA與PTC

隨著分子生物技術(shù)發(fā)展，甲狀腺相關(guān)mRNA被報道作為腫瘤診斷及其預(yù)后的分子標(biāo)志物，尤其是甲狀腺特異性mRNA，主要包括促甲狀腺激素受體（thyroid-stimulating hormone receptor，TSHr）mRNA和甲狀腺球蛋白（thyroglobulin）mRNA。Wagner等［18］利用quantitative RT-PCR檢測72例患者術(shù)前TSHr mRNA的表達（36例DTC和36例甲狀腺良性結(jié)節(jié)），其研究結(jié)果提示，在FNA細胞學(xué)檢測為不確定的患者中，TSHr mRNA靈敏度和特異度分別為75%和78%，并指出TSHr mRNA結(jié)合FNA將提高檢測的靈敏度和特異度，分別達到95%和89%。同樣，Chia等［19］研究檢測60例FNA不能確診的甲狀腺腫瘤樣本，與術(shù)后病理比較，其TSHr mRNA檢測的準(zhǔn)確率達68%。因此，雖然FNA仍有不可替代的地位，但TSHr mRNA可能可以作為FNA不能確診患者的補充診斷方法。

血清甲狀腺球蛋白是目前臨床用于甲狀腺腫瘤預(yù)后和復(fù)發(fā)的監(jiān)測因子，血清甲狀腺球蛋白水平術(shù)后監(jiān)測腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)具有較高的靈敏度，但是仍存在一定的缺陷：對于甲狀腺腫瘤術(shù)后TSH抑制治療的患者監(jiān)測甲狀腺球蛋白缺乏靈敏度；此外，在甲狀腺球蛋白抗體陽性的患者中，血清甲狀腺球蛋白水平下降［20-21］。研究提示，循環(huán)甲狀腺球蛋白mRNA在評估PTC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移具有一定作用，可能可以彌補甲狀腺球蛋白檢測的缺陷。Chinnappa等［22］檢測19例病理提示轉(zhuǎn)移DTC患者甲狀腺球蛋白mRNA的表達，其靈敏度達到100% ，同時隨訪48例甲狀腺球蛋白mRNA陰性DTC患者，其中44例在術(shù)后隨訪中均無復(fù)發(fā)，其特異度達到94%，并提出與血清甲狀腺球蛋白水平有較好的相關(guān)性。然而，Elisei等［23］隨訪9例甲狀腺球蛋白mRNA為陽性DTC患者4年，在隨訪期間9例患者均未發(fā)生復(fù)發(fā)，提示甲狀腺球蛋白mRNA作為腫瘤復(fù)發(fā)因子缺乏一定的準(zhǔn)確性。對于甲狀腺球蛋白mRNA在甲狀腺腫瘤的術(shù)后評估的作用，目前文獻報道缺乏一致性，可能由于檢測引物設(shè)計與不同實驗條件所致［24］。此外，TSHr mRNA不僅可以作為PTC診斷的標(biāo)志，而且其作為評估PTC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移也有一定的作用。Barzon等［25］的研究提示，TSHr mRNA在PTC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移評估中有較高的特異度（80.6%）及較低的靈敏度（40%）。Chia等［26］研究術(shù)前及術(shù)后TSHr mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后第一天TSHr mRNA持續(xù)高表達，提示腫瘤有轉(zhuǎn)移及未切除病灶的可能。Milas等［27］指出，在甲狀腺球蛋白抗體陽性的患者中，檢測TSHr mRNA表達的意義高于血清甲狀腺球蛋白水平的鑒定。

3 非編碼RNA與PTC

在哺乳動物基因組中，有70%～90%的序列可被轉(zhuǎn)錄，而僅1%～2%的序列可編碼蛋白。那些不編碼蛋白的RNA序列，即非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）［28］。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的序列長度，ncRNA可分為長度小于200 bp的短鏈非編碼RNA，如微小RNA（microRNA，miRNA）、與PIWI蛋白相互作用的piRNA（PIWI-interacting RNA）、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 bp的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），以及新近發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）。由于缺少有效的開放閱讀框，ncRNA不具備蛋白編碼功能，曾一度被認為是基因組轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的廢物。然而，近年來的研究表明，ncRNA可參與染色質(zhì)修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等，從多個層面調(diào)控基因的表達，與細胞、組織乃至整個生物體的諸多生物學(xué)行為有密切聯(lián)系。

miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼單鏈小分子RNA，長為20～25個核苷酸［29］。人類超過半數(shù)miRNA位于與腫瘤相關(guān)的基因區(qū)域或脆性位點，miRNA與甲狀腺腫瘤的關(guān)系引起了人們高度的重視。有關(guān)PTC的多個研究結(jié)果顯示，腫瘤組織的miR-221、miR-222、miR-146b基因表達水平呈一致性增高［30-32］，雖然甲狀腺腫瘤組織的miRNA表達譜與甲狀腺腫瘤發(fā)病相關(guān)，但是檢測技術(shù)復(fù)雜、創(chuàng)傷大，極大地限制了其臨床應(yīng)用。相對而言，外周血容易獲得和檢測，便于臨床應(yīng)用和推廣。在血漿或血清中miRNA以相當(dāng)穩(wěn)定的形式存在，不受內(nèi)源性RNase活性的影響。2012年，我們課題組首次探討利用高通量的測序技術(shù)，建立甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺良性結(jié)節(jié)和正常對照者血清miRNA表達譜，分析血清miRNA的表達差異，探討可能區(qū)分甲狀腺癌與甲狀腺良性結(jié)節(jié)和正常對照者的血清miRNA診斷分子標(biāo)志物［33］。

我們的研究提示，不同的miRNA在血清和組織中表達呈現(xiàn)出不一致，血清let-7e可能是由于機體循環(huán)免疫細胞對腫瘤的反應(yīng)，而miR-151-5p和miR-222可能是由于腫瘤細胞的凋亡或腫瘤細胞的主動分泌過程所致。因此，對于血清miRNA的來源，可能是由于機體對于疾病狀態(tài)的整體調(diào)節(jié)，是由多條途徑導(dǎo)致的，而非單一因素導(dǎo)致血清miRNA的差異表達［33］。在我們研究的基礎(chǔ)上，Lee等［34］研究術(shù)后有復(fù)發(fā)和無復(fù)發(fā)PTC患者，提示miR-222和miR-146b在復(fù)發(fā)的PTC患者中明顯升高；相比于正常對照，血漿miR-222和miR-146b在PTC中明顯升高，并且在腫瘤切除后其血漿表達水平顯著下降，提出miR-222和miR-146b與PTC腫瘤的復(fù)發(fā)密切相關(guān)，可能可以作為腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測因子。

lncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，其本身缺乏明顯的開放閱讀框，不參與蛋白質(zhì)編碼功能，以RNA形式在多種層面上調(diào)控基因的表達水平［35］。近年有研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程［36］。隨著對lncRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中某些特定的lncRNA的表達水平會發(fā)生明顯改變，這可能與許多生物學(xué)過程有密切聯(lián)系。lncRNA在甲狀腺癌中的作用機制的研究尚處于起步階段。Jendrzejewski等［37］研究認為一個名為乳頭狀甲狀腺癌易感候選基因3（papillary thyroid carcinoma susceptibility candidate 3，PTCSC3）的lncRNA基因位于下游3.2 kb的rs94428914q.13.3基因位點。PTCSC3的表達被認為有甲狀腺特異性，并且在甲狀腺瘤組織和甲狀腺細胞系中大幅下調(diào)。Yoon等［38］報道了一種新的下調(diào)基因，NAMA（non-coding RNA associated with MAP kinase pathway and growth arrest）非編碼RNA與MAP激酶信號通路和生長阻滯相關(guān)，它與PTC活化BRAF突變V600E高度關(guān)聯(lián)。

由于lncRNA片段大于200 bp，對于在循環(huán)血中穩(wěn)定存在的可能性一直被質(zhì)疑，但近期有相關(guān)的文獻報道在循環(huán)血中穩(wěn)定存在并作為腫瘤特異分子標(biāo)志物。Zhou等［39］檢測70例GC患者和70例正常對照組血漿中8個既往被報道lncRNA的表達，其中H19在血漿中穩(wěn)定表達，在GC組中水平明顯升高，其靈敏度和特異度分別達到82.9%和72.9%，提示其作為診斷標(biāo)志物的可能性。Li等［40］的研究顯示，血清HOTAIR在宮頸癌中表達升高，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)。我們課題組前期通過芯片篩查PTC中l(wèi)ncRNA的表達譜，也正在進行血清lncRNA的檢測，試圖為甲狀腺腫瘤的分子診斷標(biāo)志物提供新的思路。

circRNA是新近確認的一類特殊的非編碼分子，是繼miRNA和lncRNA后RNA家族的一顆極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦牵彩荝NA領(lǐng)域最新的研究熱點。與傳統(tǒng)的線性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達更穩(wěn)定，不易降解。circRNA具有在細胞質(zhì)中含量豐富、結(jié)構(gòu)保守并且能穩(wěn)定存在的特點。目前在功能上研究提示有3種可能機制：circRNA分子富含miRNA結(jié)合位點，在細胞中起到miRNA海綿的作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平。這一作用機制被稱為競爭性內(nèi)源RNA機制。通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，circRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［41］。此外，有研究提出，circRNA可能通過RNA-binding protein與蛋白相結(jié)合形成RNA-protein complex而發(fā)揮功能；另外，circRNA可能含有內(nèi)部核糖體進入序列，從而參與蛋白質(zhì)的翻譯過程［41-42］。研究提示circRNA在細胞質(zhì)中穩(wěn)定存在，在血清中由于內(nèi)源性核酸酶的作用，存在的時間小于15 s［42］，但是這一說法目前也受到了質(zhì)疑，Li等［43］的研究提示與正常組織相比，Hsa_circ_002059在胃癌組織中顯著下降，并且血漿中的Hsa_circ_002059表達在腫瘤切除后與術(shù)前差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提出Hsa_ circ_002059在循環(huán)血中存在并作為分子標(biāo)志物的可能性。目前對于circRNA的研究尚處于起步的階段，對于其來源、作用機制等需要進一步的探討。

4 總結(jié)

迄今為止，雖然腫瘤相關(guān)RNA釋放入人體外周血形成循環(huán)RNA以及它們在血液中的存在形式尚未完全清楚，但其在臨床上的應(yīng)用價值正在逐步被人們所了解。隨著越來越多的研究者投身到ncRNA 與甲狀腺腫瘤研究領(lǐng)域中，發(fā)現(xiàn)各類ncRNA作用機制的多樣和復(fù)雜，因此目前對ncRNA功能的認識仍然只是冰山一角。循環(huán)ncRNA作為研究熱點處于起步階段，其能否成為甲狀腺腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志，能否預(yù)測腫瘤預(yù)后，與腫瘤個體化治療是否有關(guān)，以及能否作為腫瘤分子靶向治療的有效靶標(biāo)，諸多問題仍有待通過研究獲得答案。相信隨著生命科學(xué)技術(shù)的不斷進步，特別是新一代測序技術(shù)與基因芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用，將有助于我們更加全面真實地揭示各類RNA的功能和作用機制，也為甲狀腺腫瘤的無創(chuàng)診斷、靶向治療提供新的思路及依據(jù)。

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收稿日期：（2015-12-21）

通信作者：肖海鵬 E-mail:xiaohp@mail.sysu.edu.cn

中圖分類號：R736.1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-3639（2016）01-0025-06

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.01.004