別嘌呤醇引起發(fā)疹型藥疹8例及相關(guān)基因HLA-B*5801檢測

羅　陽，韓　悅，王寶璽，姚　煦，劉　軍

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院皮膚性病科，南京 210008)

別嘌呤醇是一種常用的治療高尿酸血癥、痛風(fēng)、急性尿酸性腎病的藥物。隨著該藥在臨床上的應(yīng)用，其引發(fā)藥物過敏的臨床報(bào)道多見。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，此藥是一些嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)(severe cutaneous adverse drug reactions,SCARs)，如藥物超敏反應(yīng)綜合征(hypersensitivity syndrome,HSS)、Stevens-Johnson綜合征(Stevens-Johnson syndrome,SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis,TEN)的常見致敏藥物[1]。近年來藥物遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物嚴(yán)重不良反應(yīng)與HLA-B特定的基因型密切相關(guān)，如別嘌呤醇引起的SJS和TEN被證實(shí)與HLA-B*5801有著明顯的相關(guān)性[2]。在臺灣漢族人群中，別嘌呤醇引起的SJS/TEN患者攜帶HLA-B*5801基因型為100%，遠(yuǎn)高于國際組織相容性工作組(International Histocompatibility Working Group，IHWG)在2010年報(bào)道的世界不同人種HLA-B*5801的平均攜帶率，其中非洲人2%～4%，白種人1%～6%，亞洲印度人3%～15%，華人8.8%～10.9%。相似的結(jié)果在我國、韓國和泰國等國家也陸續(xù)被證實(shí)[3]。但是，目前尚不明確別嘌呤醇引起的發(fā)疹型藥疹與此基因型的相關(guān)性。為此，對8例別嘌呤醇引起的發(fā)疹型藥疹患者進(jìn)行HLA-B*5801基因型的檢測。

資料與方法

一般資料

本研究經(jīng)過本院倫理委員會的批準(zhǔn)。所有入組者均簽署知情同意書。共篩選別嘌呤醇引起的發(fā)疹型藥疹患者8例(A組)，其中男5例，女3例，臨床癥狀見圖1,排除其他藥物致敏的可能和排除與藥疹相似的其他疾病的皮疹。同時還篩選了30例服用別嘌呤醇未發(fā)生藥疹的痛風(fēng)患者(B組)和120名健康體檢者(C組)。所有入組者均為漢族。

研究方法

DNA提取：采集EDTA抗凝的新鮮抗凝血，用TIANamp Blood DNA Kit提取試劑盒提取全血DNA，測DNA純度和濃度，-20 ℃保存。

儀器與試劑：HLA-B*5801檢測試劑盒(臺灣Pharmigene，Inc.，PG-5801C- 024)；qPCR儀7300(美國Applied Biosystem)；凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD GelDocTM XR+System)。

PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系分兩種：內(nèi)參體系25 μl：陽性對照模板2 μl，2×PCR Master Mix 12.5 μl，10×內(nèi)參檢測mix 2.5 μl，除酶H2O 8 μl；樣本基因型檢測體系25 μl：DNA 2 μl，2×PCR Master Mix 12.5 μl，10×內(nèi)參檢測mix 2.5 μl，除酶H2O 8 μl。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，71 ℃退火/延伸1 min，共35個循環(huán)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測：配制2%的瓊脂糖凝膠，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7 μl進(jìn)行電泳，采用凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

結(jié)果分析：每個樣本有兩個Ct值，一個是基因型，一個是內(nèi)參。Ct的差值計(jì)算：△Ct=Ct(基因型)-Ct(內(nèi)參)。根據(jù)以下情況判定結(jié)果是否為陽性，如果Ct(內(nèi)參)≤27,Ct(基因型)≤35，△Ct≤7，則HLA-B*5801陽性，△Ct>7則HLA-B*5801陰性;Ct(內(nèi)參)≤27，Ct(基因型)>35(undetermined),則HLA-B*5801陰性；如果CT(內(nèi)參)>27，可能存在PCR抑制劑，需重新檢測。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。基因頻率用相對數(shù)表示。因?yàn)橛幸唤M期望頻數(shù)小于1，故比較差異采用Fisher精確概率法，按α=0.05的水準(zhǔn)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析采用比值比(odds ratio,OR)值卡方檢驗(yàn)，計(jì)算組間的OR值及其95%CI、P值，根據(jù)總體OR值與1之間的差別來判定別嘌呤醇引起的發(fā)疹型藥疹與HLA-B*5801等位基因的相關(guān)性是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

所有病例內(nèi)參全部擴(kuò)增成功。各組標(biāo)本的HLA-B*5801檢出結(jié)果見表1。根據(jù)HLA-B*5801檢測試劑盒的判定方法進(jìn)行結(jié)果判讀。

別嘌呤醇引起發(fā)疹型藥疹患者HLA-B*5801等位基因陽性率與對照組差異比較

在別嘌呤醇引起發(fā)疹型藥疹的8例患者(A組)中，有3例患者HLA-B*5801陽性(表2)。對3例HLA-B*5801檢測陽性患者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，內(nèi)參擴(kuò)增及樣本擴(kuò)增全部成功，PCR產(chǎn)物大小正確(圖2)。進(jìn)一步證實(shí)3例患者HLA-B*5801陽性。30例服用別嘌呤醇未發(fā)生藥疹的痛風(fēng)患者(B組)中，有2例患者HLA-B*5801陽性。120名健康體檢者中，有13名體檢者HLA-B*5801陽性。采用卡方檢驗(yàn)，χ2=4.931，P>0.05。

別嘌呤醇引起發(fā)疹型藥疹患者與HLA-B*5801的基因攜帶相關(guān)性比較

藥疹組與非藥疹組HLA-B*5801基因型陽性率的比值OR=8.400，95%CI1.107～63.735，P<0.05；藥疹組與健康體驗(yàn)組的HLA-B*5801基因型陽性率OR=4.938，95%CI1.056～23.100，P<0.05?？梢哉J(rèn)為該型藥疹與HLA-B*5801的基因型攜帶具有相關(guān)性。

表1　各組標(biāo)本HLA-B*5801基因檢出情況

表2　別嘌呤醇引起發(fā)疹型藥疹患者PCR檢測結(jié)果

討　　論

藥物過敏是臨床常見問題，皮膚是主要受累器官。藥疹的臨床表現(xiàn)類型多種多樣，輕癥者以紅斑、丘疹為主，重癥者可以出現(xiàn)表皮松解和大皰。SJS和TEN屬于重癥藥疹，雖然發(fā)生率不高，但癥狀嚴(yán)重，死亡率高[4]。別嘌呤醇是治療痛風(fēng)的常用藥物，該藥物引起的藥疹發(fā)生率大約為2%～5%[5- 6]。別嘌呤醇藥疹可分為重癥藥疹與非重癥藥疹兩類。其中非重癥藥疹包括：紅斑發(fā)疹型、多形紅斑型及紫癜型；重癥藥疹包括：重癥多形紅斑型、剝脫性皮炎型及TEN。其中發(fā)疹型藥疹占35%左右[7]。鑒于HLA分子在免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色，參與將藥物抗原呈遞給T細(xì)胞表面受體從而引發(fā)免疫反應(yīng)，故HLA等位基因型別與藥物過敏的相關(guān)性成為藥物不良反應(yīng)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。1989年，Chan等[8]首次報(bào)道了HLA與別嘌呤醇引起不良反應(yīng)相關(guān)性的研究。2005年Hung等[3]首次在臺灣漢族人群中發(fā)現(xiàn)別嘌呤醇引起的SJS/TEN與HLA-B*5801之間具有強(qiáng)相關(guān)性。隨后在韓國、泰國及日本患者中也證實(shí)了SJS/TEN與HLA-B*5801之間存在關(guān)聯(lián)性，但是關(guān)聯(lián)性要比Hung等[3]的研究弱得多[9-11]。

輕癥藥疹雖然臨床危害較小，但是反復(fù)多次發(fā)病后可向重型發(fā)展。很多重型藥疹發(fā)病初期僅表現(xiàn)為輕癥皮損，所以明確別嘌呤醇過敏的發(fā)疹型患者的HLA-B*5801基因型攜帶率，可能有助于判斷疾病預(yù)后和發(fā)生重癥藥疹的風(fēng)險(xiǎn)。雖然大量研究表明HLA-B*5801與重癥藥疹的強(qiáng)相關(guān)性，但是與輕癥藥疹的關(guān)聯(lián)還有待更多的臨床研究證據(jù)，并且不同種族間的關(guān)聯(lián)性也不相同，有必要進(jìn)行我國人群此基因型與別嘌呤醇引發(fā)的輕癥藥疹間的相關(guān)性研究。本研究初步分析了HLA-B*5801基因型在別嘌呤醇引發(fā)的發(fā)疹型藥疹患者中的分布頻率，研究納入8例別嘌呤醇引起的發(fā)疹型藥疹患者，并以別嘌呤醇耐受的痛風(fēng)患者和健康體檢者為對照。顯示8例患者中3例患者HLA-B*5801檢測陽性，陽性率為37.5%，與之前部分報(bào)道[12]相符。而對照組該基因型的分布頻率分別為6.7%和10.8%，雖然各組間比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但別嘌呤醇所致的發(fā)疹型藥疹與HLA-B*5801的基因型攜帶率具有相關(guān)性(OR=8.400，95%CI：1.107～63.735，P<0.05)，提示攜帶此基因型的別嘌呤醇所致的發(fā)疹型患者發(fā)展為重癥藥疹的風(fēng)險(xiǎn)可能高于非攜帶者。值得一提的是，本研究納入的3例HLA-B*5801檢測陽性發(fā)疹型藥疹患者中，1例患者由于不能停藥，在發(fā)疹型藥疹反復(fù)發(fā)作2年后，出現(xiàn)了SJS型藥疹。本研究納入的樣本數(shù)量偏少，還有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

(本文圖1、2見插頁Ⅰ)

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