乳酸菌的組合發(fā)酵條件優(yōu)化

李曉鵬2，劉昕1 ，張忠明1，何守貴2，曹磊1，張衛(wèi)兵1

（1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州730000；2. 甘肅金亞科技發(fā)展有限公司，甘肅 蘭州730000）

乳酸菌的組合發(fā)酵條件優(yōu)化

李曉鵬2，劉昕1 ，張忠明1，何守貴2，曹磊1，張衛(wèi)兵1

（1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州730000；2. 甘肅金亞科技發(fā)展有限公司，甘肅 蘭州730000）

以甘南牧區(qū)家庭自制牦牛乳酸奶中分離篩選出的乳酸菌為試驗菌株，將其進行組合發(fā)酵試驗，以期為工業(yè)生產提供理論依據(jù)。采用單因素試驗考察了菌種組合比例、發(fā)酵溫度、加糖量等因素對酸奶品質的影響，結果表明最佳菌株組合為Q2∶G4，該組合的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度43.0 ℃、接種量4.0 %、菌株Q2∶G4的比例為1∶3。

組合發(fā)酵; 乳酸菌；優(yōu)化

人類對乳酸菌發(fā)酵劑的研究始于19世紀末至20世紀初，Grigoroff在1905年首次對酸奶細菌學的研究，標志著人們利用自然環(huán)境中“天然乳酸菌”時代的結束[1-3]。而Petter和Lolkema在1950年發(fā)現(xiàn)酸乳生產中共同使用S.t和L.b產酸速率明顯加快則是傳統(tǒng)液體發(fā)酵劑應用的開始[4-6]。液體發(fā)酵劑使用方便、價廉，且大小生產廠家均可自行調制的特點，極大擴充了酸奶的生產領域，但在酸奶工業(yè)的進一步集約化、規(guī)模化發(fā)展中，傳統(tǒng)發(fā)酵劑多次活化和擴培的煩瑣工藝越來越不能滿足要求；伴隨著低溫干燥生物技術的發(fā)展，西方乳業(yè)發(fā)達國家已開發(fā)出了用量小、郵寄儲藏方便，能直接投入生產的多功能商品化發(fā)酵劑。

我國在發(fā)酵劑的研究方面比較滯后，目前還沒有一家專業(yè)化發(fā)酵劑生產廠商。但我國的酸奶生產中，有80%以上的酸奶使用的發(fā)酵劑是濃縮型凍干發(fā)酵劑，其中絕大部分是購自國外知名發(fā)酵劑公司，導致發(fā)酵劑市場被國外企業(yè)壟斷，每年花費高達15億元來引進酸奶發(fā)酵劑[7]。因此，對于加強國內自主研發(fā)乳酸菌發(fā)酵劑制備的研究水平和工業(yè)化生產刻不容緩。

本研究是以甘南牧區(qū)家庭自制牦牛乳酸奶中分離篩選出的乳酸菌為試驗菌株，將其進行組合發(fā)酵試驗，以期為工業(yè)生產提供理論依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌種

本實驗室自甘南牧區(qū)發(fā)酵乳中分離篩選出的菌株Q2、Q5、G1、G3、G4、G6。

1.12 試劑

胰蛋白胨，酵母粉，酵母膏，瓊脂糖，牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，磷酸氫二鉀（鈉），磷酸二氫鉀（鈉），硫酸氫二鉀（鈉），硫酸二氫鉀（鈉），氯化鈣，氯化鈉，氯化鉀，硫酸鎂，硫酸亞鐵，氯化鈉，硫酸錳，乙醇，雙乙酰，氫氧化鈉，以上試劑均為分析純。脫脂奶粉（黑龍江完達山）為市售。

1.13 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基、SL培養(yǎng)基、Elliker培養(yǎng)基、脫脂乳固體培養(yǎng)基及脫脂乳液體培養(yǎng)基。

TJA 培養(yǎng)基：番茄汁50mL，酵母膏5g，牛肉膏10g，乳糖20g，葡萄糖2g，磷酸氫二鉀2g，吐溫-801mL，乙酸鈉5g，加蒸餾水至1000mL，調節(jié)pH6.8±0.2，于121℃滅菌15min備用[8]。

APT培養(yǎng)基：胰胨10g，吐溫-80lmL，酵母提取物5g，氯化鈉5g，檸檬酸鈉5g，硫酸鎂0.8g，葡萄糖10g，氯化錳0.14g，磷酸氫二鉀5g，硫酸亞鐵0.04g，加蒸餾水至1000mL，調整pH值為6.7～7.0，121 ℃滅菌15min[8]。

1.14 設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），YX-280A高壓滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司），HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱（南京實驗儀器廠），XSP-18S顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司），PB-203電子天平（Mettler-Toledo公司）pHS-25數(shù)顯pH計（上海精密科學儀器廠）， KUBOTA3740冷凍離心機（日本KUBOTA久保田公司），YQX-1型厭氧培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），冷凍干燥機（北京博醫(yī)康醫(yī)療器械廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 球菌與桿菌間的組合發(fā)酵

篩選菌株經過活化后，將其中的2株球菌與4株桿菌分別組合，以3%（V/V）的接種量接種于滅菌的牛奶中，41℃發(fā)酵，凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后，測定其滴定酸度及黏度，并進行感官綜合評價。球菌與桿菌的組合見表5。

1.2.2 復配比例的篩選

菌株Q2、G4活化后，將其發(fā)酵液分別按1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1（V/V）進行復配，以3%（V/V）的接種量接種于含6%（m/m）蔗糖的滅菌牛奶中，41℃培養(yǎng)，凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后，測定其酸度及黏度，并進行感官綜合評價。

1.2.3 發(fā)酵溫度的篩選

菌株Q2、G4活化后，將菌株Q2、Q4的發(fā)酵液按1∶3（V/V）進行復配后，以3%（V/V）的接種量接種于含6%（m/m）蔗糖的滅菌牛奶中，分別置于37、39、41、43、45℃培養(yǎng)，凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后，測定其酸度及黏度，并進行感官綜合評價。

1.2.4 接種量的篩選

菌株Q2、G4活化后，將菌株Q2、Q4的發(fā)酵液按1∶3（V/V）進行復配后，分別以2、3、4、5%（V/V）的接種量接種于含6%（m/m）蔗糖的滅菌牛奶中，置于43℃培養(yǎng)，凝乳后放入冰箱中4℃冷藏24h后，測定其酸度及黏度，并進行感官綜合評價。

2、結果與分析

2.1 球菌與桿菌間的組合發(fā)酵

表1 組合發(fā)酵試驗結果

由表1可見，8個組合所發(fā)酵酸奶的黏度在4.20～10.20 dpa. s之間，與市場上酸奶的黏度3～4dpa.s相比，8個組合所發(fā)酵的酸奶都有很好的黏度，且8個組合所發(fā)酵酸奶的黏度差異顯著（P＜0.05）。B3組合的黏度最高，A4組合的黏度最低，8個組合所發(fā)酵酸奶的黏度從強至弱的順序為B3＞A2＞A3＞B4＞B2＞A1＞B1＞A4。8個組合所發(fā)酵酸奶的酸度在74～100°T，滿足酸奶奶酸度70～110°T之間的要求，且8個組合所發(fā)酵酸奶的酸度存在差異顯著（P＜0.05）。8個組合發(fā)酵酸奶的酸度從高至低的順序為：A3＞A2＞B3＞A1＞B4＞B2＞A4＞B1。從感官評價結果來看，8個組合所發(fā)酵酸奶的綜合評價分值在79～88之間，8個組合發(fā)酵酸奶的綜合評價分值存在差異顯著（P＜0.05），其中，A3組合發(fā)酵酸奶的綜合評價結果最好，A2組合發(fā)酵酸奶的綜合評價結果最差。綜上所述，篩選出A3組合為最佳組合，即菌株Q2和G4的組合為最佳組合。

2.2 復配比例的篩選

表2 菌種復配比例篩選結果

由表2可見，隨著發(fā)酵劑中菌株復配比例不同，所發(fā)酵酸奶的黏度、滴定酸度及感官評價分值都出現(xiàn)明顯的變化。5種不同發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的黏度在7.00～9.10dPa.s之間，且存在顯著差異（P＜0.05）。復配比例為1∶3（V/V）時所發(fā)酵酸奶的黏度最高，復配比例為1∶1（V/V）時發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的黏度最低。滴定酸度結果顯示，5種不同發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的滴定酸度在86.00～96.00 °T之間，且存在顯著的差異（P＜0.05）。復配比例為1∶3（V/V）時所發(fā)酵酸奶的酸度最高，復配比例為1∶1（V/V）時所發(fā)酵酸奶的酸度最低，感官評價結果顯示，復配比例為1∶3（V/V）時所發(fā)酵酸奶的感官評價分值最高，與其余4種發(fā)酵劑所發(fā)酵酸奶的感官評價分值相比存在顯著的差異（P＜0.05）。綜上所述，最終篩選出最佳復配比例為1∶3，因為在接種比例為1∶3時，所發(fā)酵酸奶的黏度比較高，組織狀態(tài)比較好，乳清析出也比較少，且發(fā)酵酸奶的滋氣味也比較好。

2.3 發(fā)酵溫度的篩選

表3 單因素試驗最佳發(fā)酵溫度篩選結果

由表3可見，隨著發(fā)酵溫度的變化，所發(fā)酵酸奶的黏度、滴定酸度及感官評價分值都出現(xiàn)較大的變化。著發(fā)酵溫度的逐步升高，5個溫度下所發(fā)酵酸奶的黏度也呈現(xiàn)遞增的趨勢。5個溫度下所發(fā)酵酸奶的黏度在12～15dPa.s，說明5個溫度下所發(fā)酵酸奶都具有很好的黏度。37℃下發(fā)酵的酸奶黏度最高，45℃下發(fā)酵的酸奶黏度最低，且不同溫度下所發(fā)酵的酸奶黏度存在顯著性差異（P＜0.05），因為發(fā)酵溫度高時菌株發(fā)酵產酸比較快，酪蛋白凝結過快造成乳清析出，所以黏度就比較低。隨著發(fā)酵溫度的逐步升高，5個溫度下所發(fā)酵酸奶的酸度也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。5個溫度下所發(fā)酵酸奶的酸度在85～100°T之間，在酸奶產品要求的70～110°T之內。43℃下所發(fā)酵酸奶的酸度最高，37℃下所發(fā)酵酸奶的酸度最低，且5個溫度下所發(fā)酵酸奶的酸度存在顯著性差異（P＜0.05），因為所篩選菌株均為高溫發(fā)酵菌株，在低溫狀態(tài)下代謝比較慢，產酸能力也比較弱。隨著發(fā)酵溫度的逐步升高，5個溫度下所發(fā)酵酸奶的感官評價分值也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。43℃下所發(fā)酵酸奶的感官評價分值最高，37℃下所發(fā)酵酸奶的感官評價分值最低，且5個溫度下所發(fā)酵酸奶的感官評價分值存在顯著性差異（P＜0.05），因為發(fā)酵溫度過高，菌株發(fā)酵酸奶的組織狀態(tài)比較差；發(fā)酵溫度過低，菌株產酸速率比較低，發(fā)酵酸奶的滋氣味比較差。綜上所述，篩選出43℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.4 接種量的篩選

表4 單因素試驗最佳接種量試驗結果

由表4可見，不同的接種量對發(fā)酵酸奶的黏度、酸度及感官評價分值均有較大的影響。黏度測定結果顯示，4個接種量時所發(fā)酵酸奶的黏度都在9～11dPa.s之間，與市場現(xiàn)有酸奶的黏度相比偏高。2%接種量時所發(fā)酵酸奶的黏度最高，4%接種量時所發(fā)酵酸奶的黏度最低，4個接種量時所發(fā)酵酸奶的黏度存在顯著性差異（P＜0.05），因為接種比例大，菌體發(fā)酵過程中菌體數(shù)增長比較快，產生的乳酸比較多，產酸過快容易造成乳清析出。酸度測定結果顯示，4個接種量時所發(fā)酵酸奶的酸度在90～100°T之間，在酸奶產品要求的70～110°T之內。4%接種量時所發(fā)酵酸奶的酸度最高，2%接種量時所發(fā)酵酸奶的酸度最低，4個接種量時所發(fā)酵酸奶的酸度存在顯著性差異（P＜0.05）。感官評價結果顯示，4% 接種量時所發(fā)酵酸奶的感官評價分值最高，2%接種量對應發(fā)酵酸奶的感官評價分值最低，4個接種量時所發(fā)酵酸奶的酸度存在顯著性差異（P＜0.05）。綜上所述，在接種量為4%時，菌株發(fā)酵酸奶的感官狀態(tài)最好，因此，篩選出最佳接種量為4%。

3、結論

通過組合發(fā)酵試驗篩選出菌株Q2∶G4為最佳組合，該組合的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度43.0℃、接種量4.0%、菌株Q2∶G4的比例為1∶3時，所發(fā)酵酸奶的組織狀態(tài)好，感官評價值最高，為94.90分。

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蘭州市科技計劃項目（項目編號2015-3-138）

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