益氣養(yǎng)陰方對宮頸癌大鼠免疫功能及癌組織的影響

趙向榮 牛廣旭 張小輝

摘要 目的：探討益氣養(yǎng)陰方對宮頸癌大鼠免疫功能及癌組織P16、Ki67、P53、Survivin表達的影響。方法：采用右前腋下接種宮頸癌細胞U14的方法構建宮頸癌大鼠模型，將宮頸癌大鼠隨機分為模型組、低劑量實驗組和高劑量實驗組，每組12只。低劑量實驗組和高劑量實驗組大鼠分別灌胃益氣養(yǎng)陰方0.435、1.36 mL/kg/d，模型組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)干預30 d。采用流式細胞儀檢測大鼠外周血免疫性T細胞亞群;采用HE染色與Wb法分別檢測癌組織病理學變化與P16、Ki67、P53、Survivin蛋白表達。結果：與模型組比較，低劑量實驗組和高劑量實驗組大鼠外周血CD3+、CD4+、NKT細胞比例及癌組織P16、P53蛋白相對表達量均升高，高劑量實驗組高于低劑量實驗組;CD8+細胞比例、腫瘤重量與體積及癌組織Ki67、Survivin蛋白相對表達量均降低或縮小，高劑量實驗組低于或小于低劑量實驗組（P<0.05）;且高劑量實驗組的抑瘤率高于低劑量實驗組（P<0.05）。結論：益氣養(yǎng)陰方可有效上調宮頸癌大鼠癌組織P16、P53蛋白表達，下調Ki67、Survivin蛋白表達，從而抑制腫瘤生長，同時改善免疫功能，發(fā)揮治療宮頸癌的作用。

關鍵詞 宮頸癌;益氣養(yǎng)陰方;免疫功能;癌組織;抑瘤率

Abstract Objective：To investigate the effects of Yiqi Yangyin Formula on the immune function and the expression of P16， Ki67， and P53， Survivin in cancer tissues of cervical cancer rats. Methods：The cervical cancer rat model was constructed by inoculating cervical cancer cells U14 in the right anterior armpit， and the cervical cancer rats were randomly divided into a model group and a low/high dose experimental group， each with 12 rats. Rats in the low/high-dose experimental group were given 0.435 and 1.36 mL/（kg·d） of Yiqi Yangyin Formula， respectively by gavage， and the model group was given the same amount of normal saline for 30 days. Flow cytometry was used to detect the peripheral blood immune T cell subsets in rats; HE staining and Wb method were used to detect the pathological changes of cancer tissues and the expression of P16， Ki67， P53， and Survivin protein， respectively. Results：Compared with the model group， the ratio of CD3+， CD4+， NKT cells and the relative expression of P16 and P53 proteins in the peripheral blood of rats in the low/high-dose experimental group were increased. The high-dose experimental group was higher than the low-dose experimental group; CD8+ cell ratio， tumor weight and volume， and the relative expression of Ki67 and Survivin protein in cancer tissues were reduced or shrunk. The high-dose experimental group was lower or lower than the low-dose experimental group（P<0.05）; and the tumor suppression rate of the high-dose experimental group was higher than that of the low-dose experimental group（P<0.05）. Conclusion：Yiqi Yangyin Formula can effectively up-regulate the expression of P16 and P53 protein in cervical cancer tissues， and down-regulate Ki67， Survivin protein expression， inhibit tumor growth， improve immune function， and play a role in treating cervical cancer.

Keywords Cervical cancer; Yiqi Yangyin Formula; Immune function; Cancer tissue; Tumor inhibition rate

中圖分類號：285.5;R273文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.013

宮頸癌是指發(fā)生于宮頸陰道部或移行帶鱗-柱狀上皮細胞交界處的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，且呈年輕化與上升趨勢，嚴重危害女性的生命健康[1-2]。傳統(tǒng)的治療方案如手術、放療、化療等由于不良反應大、損傷機體的免疫功能等問題，在臨床應用中受限。中醫(yī)學理論認為癌癥的發(fā)生與機體邪氣入侵、體內正氣虛弱有關，中醫(yī)藥具有調理機體內環(huán)境，抑制細胞因子，增強機體免疫力等作用[3]。益氣養(yǎng)陰方是臨床治療腫瘤的常用藥物之一，該方可通過提高機體免疫功能、誘導腫瘤細胞凋亡等抑制腫瘤生長[4]。本研究通過建立宮頸癌大鼠模型觀察益氣養(yǎng)陰方改善機體免疫功能的效果及對癌組織P16、Ki67、P53、Survivin表達的影響，旨在尋求治療宮頸癌的新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與宮頸癌細胞株 U14 SPF級、昆明雌鼠，6周齡，體質量20～22 g，購于河北省實驗動物中心，合格證號SCXK（冀）2018-004。飼養(yǎng)環(huán)境和條件：飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學實驗動物中心屏障環(huán)境動物實驗室，每籠5只，溫度（25±2）℃，濕度（55±2）%，光照明暗時間比為12 h/12 h，自由獲取食物和水。

宮頸癌細胞株U14，由中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供。培養(yǎng)條件[5]：將復蘇的宮頸癌細胞株U14置于RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h，待細胞處于對數(shù)生長期終止培養(yǎng)，以1 200 r/min，離心半徑8 cm，離心10 min，制備1×107個/mL的宮頸癌U14細胞懸液，待用。

1.1.2 藥物 益氣養(yǎng)陰方（黃芪15 g、太子參15 g、白術10 g、茯苓8 g、生地黃10 g、黃精7 g、天門冬10 g、麥門冬10 g、玄參15 g、小薊10 g、墨旱蓮10 g、女貞子10 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮10 g、蒲公英5 g），所有飲片均購自本院中藥房。

1.1.3 試劑與儀器 流式細胞儀檢測試劑盒（批號：180409）、兔抗鼠CD3+、CD4+、CD8+（批號：170912）、自然殺傷性T細胞（NKT）單抗（批號：M180702），均購自美國BD公司;兔抗鼠P16抗體（批號：D180620）、兔抗鼠P53抗體（批號：D180803），均購自英國Abcam公司;兔抗鼠Ki67、Survivin抗體（批號：H180814、H180811），購自美國Cell Signaling Technology公司等。

FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司，型號：MSD100）;Couvter型高速冷凍離心機（美國Beckman公司，型號：MST-D1200）;HM355S型石蠟切片機（德國MeKa公司，型號：GLS-D5100）;CX21型光學顯微鏡（日本Olympus公司，型號：JSD-C1511）;Spectra Max M5型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司，型號：MSL-C9810）;QuantityOne 1-D軟件（美國Bio-Rad公司，型號：KSS-H1910）等。

1.2 方法

1.2.1 模型建立[6]與分組 采用大鼠右前腋下接種宮頸癌細胞U14的方法誘導構建宮頸癌大鼠模型，取0.2 mL細胞懸液接種于大鼠右前腋下，待有明顯腫瘤結節(jié)，腫瘤直徑達到約1 cm為宮頸癌大鼠模型建立成功。將成功構建的宮頸癌大鼠隨機分為模型組、低劑量實驗組、高劑量實驗組，每組12只。

1.2.2 干預方法 低/高劑量實驗組大鼠分別予益氣養(yǎng)陰方0.435、1.36 mL/（kg·d）（生藥含量為2.0 g/mL）灌胃，模型組在同時間點予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)干預30 d。

1.2.3 流式細胞儀[7]檢測大鼠外周血免疫性T細胞亞群 末次給藥后，禁食12 h，采集各組大鼠靜脈血3 mL至流式管中，分別加入50 μL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血和10 μLCD3+、CD4+、CD8+、NKT單抗，避光孵育20 min;加入2 mL溶血素，避光孵育20 min，2 000 r/min，離心半徑8 cm，離心10 min，棄上清;加2 mL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）混勻，離心棄去上清，加2 mLPBS重懸混勻后，采用流式細胞儀分析外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+和NKT細胞比例。

1.2.4 檢測各組腫瘤體積和重量 采血后過量麻醉處死各組大鼠，將腫瘤完整剝離取下，用游標卡尺測量腫瘤的長徑a和短徑b[8]，計算腫瘤體積：V=a×b2/2;同時測量腫瘤重量，計算平均值及抑瘤率，抑瘤率=（模型組瘤重-實驗組或陽性對照組組瘤重）/模型組瘤重×100%。

1.2.5 蘇木精-伊紅（HE）染色[9]觀察癌組織病理形態(tài)學變化 腫瘤剝離稱重后，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片（約4 μm），行HE常規(guī)染色，光學顯微鏡下觀察癌組織病理學形態(tài)。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Wb）法[10]檢測癌組織P16、Ki67、P53、Survivin蛋白表達 取液氮中保存的癌組織，提取總蛋白，并進行蛋白定量。蛋白經(jīng)電泳分離后，轉膜、封閉1 h。分別加入一抗（兔抗鼠P16、P53抗體，兔抗鼠Ki67、Survivin抗體），4 ℃孵育過夜;加入二抗（IgG），室溫孵育1 h。經(jīng)化學發(fā)光底物顯像，以β-actin為內參照，采用凝膠成像儀分析系統(tǒng)QuantityOne 1-D軟件掃描條帶的灰度值，計算目的蛋白與β-actin灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，符合正態(tài)分布時，2組間比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析;不符合正態(tài)分布時，采用秩和檢驗分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠外周血免疫性T細胞亞群分布比較 ?與模型組比較，低/高劑量實驗組大鼠外周血CD3+、CD4+和NKT細胞比例均升高，且高劑量實驗組高于低劑量實驗組;而低/高劑量實驗組CD8+細胞比例顯著低于模型組，且高劑量實驗組低于低劑量實驗組（P<0.05）。見表1。

2.2 各組腫瘤體積、重量與抑瘤率比較 低/高劑量實驗組腫瘤體積小于模型組，且高劑量實驗組小于低劑量實驗組;低/高劑量實驗組腫瘤重量低于模型組，高劑量實驗組低于低劑量實驗組;同時高劑量實驗組的抑瘤率高于低劑量實驗組（P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠癌組織病理形態(tài)學表現(xiàn) 模型組癌組織中腫瘤細胞核大、深染，核分裂多;低/高劑量實驗組可見癌組織內大片壞死，出現(xiàn)壞死灶，腫瘤細胞出現(xiàn)核固縮或碎裂現(xiàn)象，且高劑量實驗組癌組織壞死情況較低劑量實驗組明顯。見圖1。

2.4 各組大鼠癌組織P16、Ki67、P53、Survivin蛋白表達 模型組、低劑量實驗組與高劑量實驗組大鼠癌組織P16蛋白相對表達量分別為（0.14±0.07）、（0.31±0.12）、（0.95±0.05）;P53蛋白相對表達量分別為（0.17±0.06）、（0.43±0.11）、（0.86±0.13）;Ki67蛋白相對表達量分別為（0.84±0.12）、（0.37±0.14）、（0.15±0.07）;Survivin蛋白相對表達量分別為（0.78±0.11）、（0.34±0.12）、（0.13±0.06）。與模型組比較，低/高劑量實驗組大鼠癌組織P16、P53蛋白相對表達量均顯著升高，且高劑量實驗組高于低劑量實驗組;低/高劑量實驗組大鼠癌組織Ki67、Survivin蛋白相對表達量低于模型組，且高劑量實驗組低于低劑量實驗組（P<0.05）。見圖2。

3 討論

宮頸癌是發(fā)病率高、致死率高的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，雖然目前宮頸癌的診斷已基本完善，但其治療仍是該病的難點[11]。目前外科手術及術后化療是治療宮頸癌的主要手段，但對于中晚期及復發(fā)轉移的患者療效較差，且易產(chǎn)生骨髓抑制、神經(jīng)損傷等嚴重不良反應[12]。中醫(yī)婦科學將宮頸癌列入“癥瘕”范疇，其最常見病因為痰濕結聚，常與血瘀相伴，終積為“癥”，故中醫(yī)辨證以痰濕癥瘕型多見，治則為化痰軟堅散結，活血祛瘀消癥;同時腫瘤患者的惡病質通常是由于氣血陰陽不足，正氣虛弱，邪氣入侵引起。中醫(yī)學認為，正氣是防治疾病及抵御外在邪氣入侵的基本[13-14]。中醫(yī)藥扶正法具有補氣固表、增強機體抵抗力、益氣溫陽、滋陰養(yǎng)血等功能，而益氣養(yǎng)陰方以茯苓、甘草、石斛、白術、黃芪、山藥、麥冬、制龜甲、北沙參、白花蛇舌草等中藥配伍入藥而成，方中黃芪、太子參、白術、茯苓健脾益氣、養(yǎng)陰清熱，潤肺生津;生地黃、黃精、天門冬、麥門冬、玄參、小薊、墨旱蓮、女貞子養(yǎng)陰補腎、涼血止血;白花蛇舌草、半枝蓮、蒲公英清熱解毒。該方從中醫(yī)整體觀點出發(fā)，辨證論治，注重標本兼顧，從攻邪而不傷正、扶正而不留邪出發(fā)，遣方用藥切中腫瘤晚期轉移之氣陰兩虛、瘀毒內結的病機，臨床治療腫瘤取得較好療效[15]。本研究結果顯示，與模型組比較，低/高劑量實驗組大鼠外周血CD3+、CD4+和NKT細胞含量均升高，而CD8+細胞含量、腫瘤重量降低，同時腫瘤體積縮小，提示益氣養(yǎng)陰方可有效抑制宮頸癌大鼠腫瘤的生長，同時改善免疫功能，發(fā)揮治療宮頸癌的作用。研究發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰方劑可抑制Lewis肺癌移植小鼠腫瘤的生長，發(fā)揮抗癌作用，且其作用機制可能與益氣養(yǎng)陰方調控癌組織中Notch1信號通路及CD4+CD25+Treg細胞有關[16]。文獻顯示，白花蛇舌草與黃芪所含黃芪總黃酮均具有提高免疫能力的效果，能夠改善肺癌患者的免疫功能[17]。

腫瘤的生長、遷襲與轉移等是多種癌基因和抑癌基因的表達、調控及細胞凋亡參與的復雜過程，P16是一種新型抑癌基因，可阻止細胞由G1期進入S期，抑制細胞增殖，而在宮頸癌中存在P16的突變、缺失，導致宮頸癌細胞無限制增生，參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[18];P53是細胞增生的主要負調控子，該基因的突變或缺失可使宮頸癌細胞異常增殖和惡性轉化;Ki67是一種細胞增殖核抗原，其高表達是細胞增殖活躍的重要標記，可反映宮頸癌細胞的增殖活性，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移、復發(fā)及預后等有關[19]。Survivin是一種凋亡抑制因子，在細胞中呈周期依賴性表達，其異常表達可引起細胞凋亡抑制，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關，可預示其不良預后[20]。目前關于宮頸癌與P16、Ki67、P53、Survivin表達的研究多集中于相關性分析及臨床意義等方面，利用藥物干預影響P16、Ki67、P53、Survivin表達方向的研究較少，本研究結果顯示，與模型組比較，低/高劑量實驗組大鼠癌組織P16、P53蛋白相對表達量均顯著升高，而Ki67、Survivin蛋白相對表達量降低，提示益氣養(yǎng)陰方可通過上調宮頸癌大鼠癌組織P16、P53蛋白表達，同時下調Ki67、Survivin蛋白表達，抑制宮頸癌細胞增殖，進而抑制腫瘤生長，但關于益氣養(yǎng)陰方對宮頸癌的免疫調節(jié)與抗腫瘤作用是否還存在其他的作用機制還需進一步深入的研究。

參考文獻

[1]ManzoMerino J，Contrerasparedes A，VázquezUlloa E，et al.The role of signalingPathways in cervical cancer and molecular therapeutic targets[J].ArchMedRes，2014，45（7）：525-539.

[2]楊濤，周日永，張競雄，等.右美托咪定在老年患者子宮頸癌根治術中對瑞芬太尼麻醉后痛覺過敏的影響[J].中國醫(yī)藥，2016，11（11）：1687-1690.

[3]趙春麗.中西醫(yī)結合治療宮頸癌放、化療后常見毒副反應研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2014，11（6）：251-252.

[4]Mohammad K. Ashfaq，Mohamed Sadek Abdel-Bakky，Mir Tahir Maqbool，et al.A Preliminary Study on Combination Therapy of Artemisinin Dimer Oxime and Topotecan against Nonsmall Cell Lung Cancer in Mice[J].World J Tradit Chin Med，2018，4（1）：8-14.

[5]崔開穎，趙素芬，朱根海.姜黃素對宮頸癌大鼠的影響及作用機制研究[J].中國臨床藥理學雜志，2019，35（11）：1142-1145.

[6]鄭智唯，劉朝奇，趙云，等.超聲微泡介導miR-34a聯(lián)合DOX治療小鼠U14皮下移植瘤的實驗研究[J].中國超聲醫(yī)學雜志，2018，34（7）：664-667.

[7]陳祥艷，孫云，陳舒，等.姜黃素對宮頸癌小鼠的抗腫瘤活性及免疫功能的影響[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2019，36（15）：1861-1864.

[8]張鳳，邢麗娜，馬艷偉，等.1，25-二羥基維生素D3對鼠宮頸癌免疫作用的研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報，2015，49（1）：30-33.

[9]張明星，李桂玲，徐叢劍.掌葉半夏提取物的有效部位不同給藥途徑對人宮頸癌細胞株CaSki裸小鼠移植瘤的抑制作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（1）：199-202.

[10]趙蕊，高旭，邵興月.馬齒莧多糖對荷宮頸癌小鼠免疫刺激活性的研究[J].中國免疫學雜志，2014，30（10）：1344-1348.

[11]Campos NG，Burger EA，Sy S，et al.An updated natural history model of cervical cancer：Derivation of model parameters[J].AmJEpidemiol，2014，180（5）：545-555.

[12]Ding ZJ，Xu DQ，Lao YZ，et al. Interactions Between Traditional Chinese Medicine and Anticancer Drugs in Chemotherapy[J].World J Tradit Chin Med，2017，3（3）：38-45.

[13]姜家康，任立瑾，遲文成.宮頸癌“癌毒”的發(fā)病、致病特點及其治療的探討[J].中醫(yī)臨床研究，2014，6（2）：134-136.

[14]Jiang E，Sun X，Kang H，et al.Dehydrocostus lactone in hibits proliferation，antiapoptosis，and invasion of cervical cancer cells through PI3K/Akt signaling pathway[J].IntJGynecolCancer，2015，25（7）：1179-1186.

[15]許軍，施長杲，秦漢林，等.益氣養(yǎng)陰解毒方對晚期肝癌介入治療減毒增效作用的臨床研究[J].安徽醫(yī)藥，2017，21（3）：541-545.

[16]楊國良，胡丹丹.益氣養(yǎng)陰方影響Lewis肺癌移植小鼠腫瘤生長的實驗研究[J].中華全科醫(yī)學，2016，14（10）：1623-1625，1788.

[17]姜慶玲.益氣養(yǎng)陰中藥對放療后肺癌患者老年生活質量和免疫功能的影響[J].中國醫(yī)藥導刊，2015，17（1）：80-81.

[18]Ahmad A，Raish M，Shahid M，et al.The synergic effect of HPV infection and epigenetica nomaly of the p16 genein the development of cervical cancer[J].CancerBiomark，2017，19（4）：1-7.

[19]Kanthiya K，Khunnarong J，Tangjitgamol S，et al.Expression of the P16 and Ki67 in cervical squamous in traepithe lialLesions and cancer[J].AsianPacJCancerP，2016，17（7）：3201-3206.

[20]謝慧君，袁明明，王偉偉，等.宮頸癌新輔助化療前后Survivin、VEGF和Ki-67的表達及臨床意義[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2014，18（19）：81-83.

（2020-03-27收稿 責任編輯：芮莉莉）