牛膝促神經(jīng)干細(xì)胞增殖的有效部位篩選

楊芊芊 高歌 王瀚澤

摘要 目的：研究牛膝不同提取分離部位對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用。方法：采用系統(tǒng)溶劑法以及柱色譜法將牛膝分成不同部位，以CCK-8法檢測(cè)牛膝各部位對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖的效果，并篩選出較好的作用部位和濃度。結(jié)果：牛膝正丁醇部位（25 μg/mL，P<0.01）和其多糖部位（12.5 μg/mL，P<0.01）對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性有明顯促進(jìn)作用。結(jié)論：牛膝正丁醇部位和多糖部位可能是其促神經(jīng)干細(xì)胞增殖的主要活性部位。

關(guān)鍵詞 牛膝;神經(jīng)干細(xì)胞;增殖;活性部位篩選

Abstract Objective：To study the effects of different extracted parts of twotoothed achyranthes root on the proliferation of neural stem cells cultured in vitro. Methods：The systemic solvent method and column chromatography were used to separate the twotoothed achyranthes root into different parts. The effects of various parts of twotoothed achyranthes root on the proliferation of neural stem cells were detected by CCK-8 method， and the optimal parts and concentration was screened. Results：The n-butanol part（25 μg/mL，P<0.01）and the polysaccharide part（12.5 μg/mL， P<0.01）significantly promoted the proliferation of neural stem cells. Conclusion：The n-butanol and polysaccharide part of twotoothed achyranthes root may be the main part for promoting the proliferation of neural stem cells.

Keywords Twotoothed achyranthes root; Neural stem cells; Proliferation; Bioactive part screening

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.002

多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿茲海默癥、帕金森氏癥、亨廷頓氏癥均顯示與功能性神經(jīng)細(xì)胞大量丟失相關(guān)[1]。神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)高度依賴于神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞（Neural Stem Cells，NSCs）作為一類神經(jīng)前體母細(xì)胞，不僅具有高度自我更新能力，而且存在多向分化的潛能[2]。NSCs主要存在于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如腦室下區(qū)和海馬區(qū)齒狀回[3]。在特定的環(huán)境中，NSCs的增殖分化過程受到胞內(nèi)信號(hào)分子以及胞外信號(hào)分子的調(diào)控，隨后增殖分化成包括神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星狀膠質(zhì)細(xì)胞等在內(nèi)的不同類型的神經(jīng)細(xì)胞[4]。而NSCs由于其高度的自我更新能力以及可塑潛能成為目前應(yīng)用前景廣闊的細(xì)胞替代療法[5]。

中醫(yī)認(rèn)為腎和腦關(guān)系密切，腎為先天之本，藏精生髓，上通于腦，因此，腎精不足，髓海失充，治療時(shí)以補(bǔ)腎填精為主。牛膝為莧科牛膝屬植物Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，牛膝味甘性微溫，入肝腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，引血下行等功效[6]。牛膝中含有齊墩果酸型三萜皂苷類化合物、甾酮類化合物以及多糖類化合物等多種化學(xué)成分[7]，因而具有多種藥理活性，如促進(jìn)大鼠NSCs的再生作用[8]、調(diào)節(jié)免疫作用[7]等。在本課題組關(guān)于人參皂苷、三七皂苷等中藥活性成分對(duì)NSCs存活、增殖和分化的藥理作用機(jī)制探討中已成功分離培養(yǎng)了胚鼠NSCs，并通過免疫熒光染色鑒定為NSCs，且純度達(dá)到95%[9-11]。基于此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究牛膝的不同提取分離部位對(duì)體外培養(yǎng)的胚鼠NSCs的增殖作用，為進(jìn)一步探索牛膝促NSCs增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠1只，約450 g，懷孕15～17 d，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0002，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)動(dòng)物房，于室溫約24 ℃，自然晝夜節(jié)律飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 藥物 牛膝（安國(guó)市昌達(dá)中藥材飲片有限公司，批號(hào)1901001），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系劉春生教授鑒定為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM/F12（賽默飛公司，美國(guó)，貨號(hào)：C11330500BT），B27添加劑（賽默飛公司，美國(guó)，貨號(hào)：17504-044），胎牛血清（天杭生物科技公司，貨號(hào)：70220-8611），bFGF（賽默飛公司，美國(guó)，貨號(hào)：DXT-13256029），CCK-8（同仁化學(xué)研究所，日本，貨號(hào)：CK04）;倒置相差顯微鏡（尼康公司，日本，型號(hào)：ECLIPSE Ts2），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛公司，美國(guó)，型號(hào)：3111），酶標(biāo)儀（Bio Tek公司，美國(guó)，型號(hào)：Epoch）。

1.2 方法

1.2.1 牛膝不同分離部位的制備 牛膝經(jīng)70%乙醇回流提取，濃縮，得牛膝醇提物。醇提水沉后，得牛膝沉淀和牛膝上清;牛膝上清經(jīng)水飽和正丁醇萃取，濃縮后得到牛膝正丁醇部位和剩余水部位。

1.2.2 牛膝多糖部位的制備 將1.2.1中的牛膝藥渣烘干，加水煎煮，濃縮，濃縮液緩慢加乙醇并攪拌至含醇量為80%，沉淀用80%乙醇洗滌，經(jīng)脫蛋白后制得牛膝多糖部位。

1.2.3 牛膝正丁醇部位經(jīng)大孔樹脂洗脫的制備 ? 牛膝正丁醇部位過AB-8型大孔樹脂柱，以水和10%、30%、50%、70%、90%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)濃縮后得不同洗脫部位，依次編號(hào)為Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5和Fr.6。

1.2.4 完全培養(yǎng)基的配制 DMEM/F12、bFGF、B27和青鏈霉素配制成NSCs無血清的完全培養(yǎng)基。

1.2.5 藥物的配制 牛膝的各部位均用完全培養(yǎng)基配制成1 000 μg/mL的儲(chǔ)備液，過濾膜除菌，保存至4 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)前用完全培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度的工作液。

1.2.6 NSCs原代培養(yǎng) 將孕鼠麻醉，取出胎鼠，置于75%乙醇中。在超凈臺(tái)內(nèi)解剖胎鼠，取出大腦，分離海馬組織并將其轉(zhuǎn)移至DMEM/F12培養(yǎng)基中，剪碎，用無菌吸管吹打至無組織團(tuán)塊，加胰蛋白酶消化，10%胎牛血清終止消化，離心，棄上清，加完全培養(yǎng)基并吹打成細(xì)胞懸液，過200目細(xì)胞篩后得單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3 d半量換液，每5～7 d傳代。

1.2.7 檢測(cè)指標(biāo)與方法 將第3代狀態(tài)良好的NSCs以5.0×105/mL密度接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，然后在各給藥組中分別加入100 μL不同濃度的牛膝提取物的工作液。其中牛膝醇提物、牛膝多糖、牛膝上清、牛膝沉淀、牛膝正丁醇部位和剩余水部位的終濃度依次為6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL;而牛膝正丁醇層過大孔樹脂的各洗脫部位Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5和Fr.6的終濃度依次為1.55 μg/mL、3.1 μg/mL、6.2 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL。對(duì)照組各孔分別加入100 μL完全培養(yǎng)基。藥物調(diào)零組（不含細(xì)胞）各孔分別加入100 μL完全培養(yǎng)基和100 μL對(duì)應(yīng)濃度的各藥物的工作液。空白調(diào)零組（不含細(xì)胞）各孔分別加入200 μL完全培養(yǎng)基。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（OD）值。實(shí)驗(yàn)平行3次。細(xì)胞增殖率的計(jì)算公式如下：增殖率（%）=[（OD調(diào)整給藥組-OD調(diào)整對(duì)照組）/OD調(diào)整對(duì)照組]×100%。其中，OD調(diào)整給藥組=給藥組OD值-藥物調(diào)零組OD值;OD調(diào)整對(duì)照組=對(duì)照組OD值-空白調(diào)零組OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCs原代培養(yǎng)與鑒定 剛接種時(shí)，在顯微鏡下可見均勻分布且透亮圓球狀的單個(gè)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng);24 h后鏡下觀察可見由數(shù)個(gè)細(xì)胞聚集成不規(guī)則透亮的細(xì)胞團(tuán)，周圍懸浮著一些透光性差的細(xì)胞碎片;72 h后鏡下可見立體感強(qiáng)且折光率大的類圓形神經(jīng)球，同時(shí)存在少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng);5～7 d后，鏡下可見大量神經(jīng)球且神經(jīng)球的體積和數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而變大增多。傳代后的NSCs，細(xì)胞碎片明顯減少，鏡下視野更純凈。見圖1。上述經(jīng)原代分離培養(yǎng)得到的NSCs，在本課題組前期實(shí)驗(yàn)工作中已被鑒定為NSCs，且純度達(dá)95%[11]。

2.2 牛膝醇提物與牛膝多糖對(duì)NSCs增殖能力的影響 本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8法檢測(cè)各組吸光度值，并采用1.2.7中的公式對(duì)其增殖率進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1、圖2。牛膝多糖（6.25 μg/mL，12.5 μg/mL，25 μg/mL，50 μg/mL，P<0.05）對(duì)NSCs的增殖有顯著的促進(jìn)作用。

2.3 牛膝上清與牛膝沉淀對(duì)NSCs增殖能力的影響 ?牛膝上清（25 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，P<0.05）對(duì)NSCs的增殖有顯著的促進(jìn)作用;牛膝沉淀與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2、圖3。

2.4 牛膝正丁醇部位與牛膝剩余水部位對(duì)NSCs增殖能力的影響 牛膝正丁醇部位（12.5 μg/mL，25 μg/mL，50 μg/mL，P<0.05）對(duì)NSCs的增殖有顯著的促進(jìn)作用;剩余水部位與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果如表3及圖4所示。

2.5 牛膝正丁醇部位過大孔樹脂柱后，其各洗脫部位對(duì)NSCs增殖能力的影響 水和10%、30%、50%、70%、90%的乙醇梯度洗脫，得不同洗脫部位，依次編號(hào)為Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5和Fr.6。其多個(gè)洗脫部位（Fr.2，F(xiàn)r.3，F(xiàn)r.4，F(xiàn)r.5，F(xiàn)r.6）均顯著地促進(jìn)NSCs增殖（P<0.05），當(dāng)藥物濃度為3.1 μg/mL時(shí)，F(xiàn)r.3，F(xiàn)r.4，F(xiàn)r.5和Fr.6部位促NSCs增殖能力最佳。見表4、圖5。

3 討論

神經(jīng)退行性疾病是全球老年人中發(fā)病率較高的疾病之一，其缺乏有效的治療手段，嚴(yán)重危害其身心健康。該疾病是由于神經(jīng)元及髓鞘逐漸喪失而導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙[12]。NSCs是一類具有增殖、遷移和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞群[2]。其自我更新能力和分化潛能為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了廣闊前景，最大程度地激發(fā)內(nèi)源性NSCs增殖、遷移至病灶（損傷區(qū)域），可促使其分化成相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞，參與神經(jīng)修復(fù)并恢復(fù)大腦受損功能。

中醫(yī)的腎-腦相關(guān)理論源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“人始生，先成精，精成而腦髓生”“腦為髓之?！钡扔涊d。腎精化生為腦髓，髓海得養(yǎng)，腦的生理功能才可以發(fā)揮正常[13]。中醫(yī)所指的“腦髓”，類似于現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)的腦內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，當(dāng)腦內(nèi)神經(jīng)元大量丟失會(huì)造成“髓海不足”，故可以通過“補(bǔ)腎填髓”法來治療“髓海空虛”的腦部疾病[14]。中醫(yī)理論中的“精”（先天之精和后天之精）與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的干細(xì)胞有密切的聯(lián)系，干細(xì)胞的屬性與“精”的繁衍、生長(zhǎng)發(fā)育、濡養(yǎng)的作用類似，因此可推測(cè)干細(xì)胞是先天之精在細(xì)胞層次的存在形式[15]。吉云鵬[16]通過補(bǔ)腎方藥對(duì)腎虛大鼠進(jìn)行干預(yù)，探究腎主藏精和海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的內(nèi)在關(guān)系，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎方藥可通過激活Wnt信號(hào)通路來調(diào)控并促進(jìn)NSCs的增殖和分化。

牛膝味甘性微溫，入肝腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，引血下行等功效[6]。牛膝作為一種使用歷史悠久的常用中藥，其在《本草經(jīng)集注》中記載：治傷中少氣，補(bǔ)中續(xù)絕，益精，填骨髓，除腦中痛;在《本草綱目》中記載：其滋補(bǔ)之功，如牛之多力也?，F(xiàn)代藥理研究表明牛膝可提高海馬神經(jīng)元的活力，促進(jìn)海馬神經(jīng)元突起生長(zhǎng)及突觸的形成[17]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛膝正丁醇部位及其多糖部位對(duì)NSCs增殖有明顯的促進(jìn)作用，為尋找其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，并進(jìn)一步探索其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（2019-10-01收稿 責(zé)任編輯：王明）