植物乳桿菌YW11生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件研究

曹永強(qiáng), 王 輯, 趙 笑, 楊貞耐

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

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植物乳桿菌YW11生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件研究

曹永強(qiáng), 王 輯, 趙 笑, 楊貞耐*

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

摘 要:對(duì)實(shí)驗(yàn)室從西藏靈菇中篩選出的一株植物乳桿菌YW11發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的條件進(jìn)行優(yōu)化。首先通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行初步優(yōu)化,然后利用二水平正交試驗(yàn)直觀分析確定影響因素的主次順序。以胞外多糖產(chǎn)量作為響應(yīng)值,采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法,建立二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型,從而確定植物乳桿菌YW11產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)條件。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,發(fā)酵時(shí)間為18 h、碳源為乳糖(質(zhì)量濃度為15 g/L)、氮源為大豆蛋白胨(質(zhì)量濃度為15 g/L)、發(fā)酵溫度為32℃、接種量為3%、pH值為6.0。直觀分析確定影響植物乳桿菌YW11產(chǎn)胞外多糖主要發(fā)酵因素為大豆蛋白胨質(zhì)量濃度、pH值、接種量,響應(yīng)面法優(yōu)化其較佳值為:大豆蛋白胨質(zhì)量濃度為13.50 g/L,接種量為2.70%,pH值為6.27。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,在優(yōu)化的發(fā)酵條件下得到植物乳桿菌YW11胞外多糖產(chǎn)量為131.26 mg/L,與理論預(yù)測(cè)值(129.915 mg/L)相接近。

關(guān)鍵詞:植物乳桿菌;胞外多糖;發(fā)酵條件;響應(yīng)面分析

CAO Yongqiang,WANG Ji,ZHAO Xiao,et al.Optimization of fermentation conditions of Lactobacillus Plantarum YW11 for exopolysaccharides production[J].Journal of Food Science and Technology,2016,34(1):42-49.

*楊貞耐,男,教授,博士,主要從事乳品加工及其交叉學(xué)科理論及應(yīng)用方面的研究。通信作者。

胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是微生物(如細(xì)菌、酵母、真菌等)在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外形成的長鏈、高分子聚合物。近年來,隨著人們生活水平的不斷提升以及健康意識(shí)的加強(qiáng),研究與開發(fā)具有特殊功能的新型微生物EPS逐漸成為食品乃至醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。在食品工業(yè)中,乳酸菌胞外多糖作為天然的穩(wěn)定劑越來越多地應(yīng)用于發(fā)酵乳制品生產(chǎn),以改進(jìn)產(chǎn)品的理化特性,如防止乳清析出、凝乳斷裂等,提高產(chǎn)品的黏稠度和凝乳強(qiáng)度,改善產(chǎn)品的口感、流變性、穩(wěn)定性、乳化性和風(fēng)味等[1]。此外,胞外多糖作為菌體的天然屏障,對(duì)菌體有一定的保護(hù)作用,從而提高菌體在不利生長環(huán)境中的耐受性,同時(shí)胞外多糖還有利于提高菌體對(duì)腸道表面的非特異性黏附作用。研究發(fā)現(xiàn),胞外多糖具有多種生物學(xué)活性,如抗氧化、抗腫瘤、抑菌、抗誘變、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇、治療糖尿病及調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡等功能[2]。由于產(chǎn)自乳酸菌的胞外多糖對(duì)機(jī)體沒有毒副作用,且來源安全可靠,因此乳酸菌胞外多糖已成為近年來食品科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

影響乳酸菌胞外多糖合成的因素不僅與乳酸菌自身的遺傳特性有關(guān),亦與其生長環(huán)境因素相關(guān),包括培養(yǎng)基的組成(如碳源、氮源、碳氮比(C/N)等)、培養(yǎng)基的初始pH值、接種量、發(fā)酵溫度和時(shí)間等[3]。本課題組前期工作中從西藏靈菇分離篩選到一株產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌YW11,并對(duì)此純化的胞外多糖的結(jié)構(gòu)及理化特性進(jìn)行了研究,體外實(shí)驗(yàn)表明該胞外多糖具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29生長的活性[4]。因此,本研究著力于分析不同因素包括培養(yǎng)基的碳源、氮源、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和培養(yǎng)基初始pH值等對(duì)植物乳桿菌YW11發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響,并采用響應(yīng)面分析法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以期提高此種具有生物活性的胞外多糖的產(chǎn)量,為其在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌YW11(NCBI檢索號(hào):KM265361)分離于西藏靈菇樣品,本課題組實(shí)驗(yàn)室保藏。

三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、半乳糖、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、濃硫酸、重蒸酚、無水乙醇均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

CR21GⅢ型立式高速冷凍離心機(jī),日本HITACHI公司；Elx800型酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器,日本三洋公司；S20型數(shù)顯pH計(jì),上海梅特利-托利多公司；THZD型恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒儀器科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

半合成培養(yǎng)基(semi-defined medium,SDM)是由去離子水1 000 mL、胰蛋白胨10 g、酵母氮源6.7 g、K2HPO42 g、C6H5Na3O7·2H2O 5 g、CH3COONa 5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL,1 mol/L乙酸溶液調(diào)節(jié)pH值至6.6,121℃滅菌15 min制成。

1.3 植物乳桿菌YW11 EPS的分離提取

將植物乳桿菌YW11連續(xù)活化兩代后接種至SDM培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)16 h,發(fā)酵結(jié)束后,于100℃水浴加熱15 min,以滅活可能存在的降解多糖的酶類。發(fā)酵液中的EPS參考Sahlan等[5]的方法進(jìn)行分離提取。向植物乳桿菌YW11發(fā)酵液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的TCA,調(diào)節(jié)TCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)到4%,于常溫下攪拌2 h后,4℃,10 000 r/min,離心45 min,去除發(fā)酵液中的細(xì)胞和蛋白。將上清液轉(zhuǎn)移出來,加入上清液兩倍體積的無水乙醇,4℃靜置12 h,10 000 r/min,4℃,離心30 min。用蒸餾水溶解沉淀,裝入分子截流量為8 000～14 000 u的透析袋中,每8h換一次蒸餾水,透析24 h[6]。

1.4 EPS含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定EPS含量,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定490 nm處的吸光度值。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=0.007 5x-0.006 3, R2=0.999 1。

1.5 不同因素對(duì)植物乳桿菌YW11產(chǎn)EPS的影響

EPS的產(chǎn)量不僅取決于產(chǎn)EPS微生物自身的遺傳特性,也與發(fā)酵過程中微生物所處的環(huán)境狀況有關(guān)[7]。對(duì)植物乳桿菌YW11發(fā)酵條件相關(guān)的8個(gè)因素(包括培養(yǎng)基的碳源及其質(zhì)量濃度、氮源及其質(zhì)量濃度、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH值)分別進(jìn)行研究。

以EPS產(chǎn)量為指標(biāo),以SDM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將SDM培養(yǎng)基中的碳源(葡萄糖)分別以等量的乳糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、葡萄糖替換；選取乳糖質(zhì)量濃度分別為5,10,15,20,25,30 g/L；將SDM培養(yǎng)基中的氮源(胰蛋白胨)分別以等量的大豆蛋白胨,普通蛋白胨,酪蛋白胨,胰蛋白胨替換；選取大豆蛋白胨質(zhì)量濃度分別為5,10,15,20,25,30 g/L；選取接種量分別為1%,2%,3%,4%,5%,6%(其他發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度37℃,發(fā)酵時(shí)間16 h,pH 值6.6)；選取發(fā)酵溫度分別為22,27,32,37,42℃(其他發(fā)酵條件:接種量1%,發(fā)酵時(shí)間16 h,pH值6.6)；選取發(fā)酵時(shí)間分別為6,12,18,24,30 h(其他發(fā)酵條件:接種量1%,發(fā)酵溫度37℃,pH值6.6)；選取培養(yǎng)基初始pH值分別為4,5,6,7,8,9(其他發(fā)酵條件:接種量1%,發(fā)酵溫度37℃,發(fā)酵時(shí)間16 h)。

1.6 二水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn),針對(duì)影響植物乳桿菌YW11胞外多糖產(chǎn)量的因素,設(shè)計(jì)L8(27)正交試驗(yàn),確定影響因素的主次順序。

1.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化分析原理(Box-Behnken design,BBD),通過Design-Expert 8.0.5b軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),研究植物乳桿菌YW11產(chǎn)EPS的最佳發(fā)酵條件。得到最優(yōu)條件后,通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素的影響結(jié)果

2.1.1 碳源對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

碳源為微生物生長提供最主要碳素和能量。由于不同微生物的酶系存在差異,因此微生物對(duì)不同種類碳源的利用程度也存在相應(yīng)差異[8]。為了篩選最適碳源,分別選用6種不同碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖)按20 g/L的添加量替代SDM培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)碳源,EPS產(chǎn)量結(jié)果如圖1。

圖1　不同碳源對(duì)植物乳桿菌YW11 EPS產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on yields of EPS from Lactobacillus plantarum YW11

由圖1看出,植物乳桿菌YW11在6種碳源下均能產(chǎn)生EPS,但其產(chǎn)量存在顯著差異。其中以乳糖為碳源時(shí),EPS產(chǎn)量最高為59.98 mg/L,其次為麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖,半乳糖產(chǎn)量最低為13.62 mg/L。牛乳中存在大量乳糖,便于微生物利用且成本較低,因此,選擇乳糖作為碳源進(jìn)行下一步研究。

2.1.2 碳源質(zhì)量濃度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

碳源質(zhì)量濃度對(duì)EPS的合成也有著重要的影響。為了得到最佳的乳糖質(zhì)量濃度,分別選用不同質(zhì)量濃度的乳糖(5～30 g/L)添加到SDM培養(yǎng)基中,結(jié)果如圖2。

圖2　乳糖質(zhì)量濃度對(duì)植物乳桿菌YW11 EPS產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of lactose concentrations on yields of EPS from Lactobacillus plantarum YW11

由圖2可知,隨著乳糖質(zhì)量濃度的增加,EPS的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),在乳糖質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí),EPS的產(chǎn)量達(dá)到最高(44.74 mg/L)。在乳糖質(zhì)量濃度較低時(shí),乳糖僅為微生物的生長提供能量和碳元素,此時(shí)EPS的產(chǎn)量較低,隨著乳糖質(zhì)量濃度的增加,微生物的生長完成,EPS的產(chǎn)量隨即增加。當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度過大時(shí),由于打破了適合微生物生長的C/N,菌株生長緩慢,EPS的產(chǎn)生受到抑制,導(dǎo)致產(chǎn)量隨之下降。故選取乳糖質(zhì)量濃度為15 g/L進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 氮源對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

氮源的主要作用是為微生物細(xì)胞生長和代謝提供氮素及能量。為了篩選到最適合植物乳桿菌YW11產(chǎn)EPS的氮源,分別選用4種不同氮源(普通蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨)按10 g/L的質(zhì)量濃度替代SDM培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)氮源,結(jié)果如圖3。

由圖3看出,植物乳桿菌YW11利用4種不同種類的氮源都能產(chǎn)生EPS,但EPS的產(chǎn)量有顯著差異。其中,氮源為大豆蛋白胨作時(shí),EPS產(chǎn)量最高為120.01 mg/L,其次為胰蛋白胨、普通蛋白胨,酪蛋白的產(chǎn)量最低為46.57 mg/L。因此選用大豆蛋白胨作為氮源進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 氮源質(zhì)量濃度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

氮源質(zhì)量濃度對(duì)EPS的合成有著重要的影響。為了得到最佳的大豆蛋白胨質(zhì)量濃度,分別選用不同質(zhì)量濃度的大豆蛋白胨(5～30 g/L)添加到SDM培養(yǎng)基中,結(jié)果見圖4。

如圖4,隨著大豆蛋白胨質(zhì)量濃度的增加,EPS的產(chǎn)量也發(fā)生變化。當(dāng)大豆蛋白胨質(zhì)量濃度增加到15 g/L時(shí),EPS的產(chǎn)量達(dá)到最大(109.82 mg/L)；在15～25 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),EPS的產(chǎn)量相對(duì)穩(wěn)定,然而當(dāng)繼續(xù)增加質(zhì)量濃度時(shí),EPS的產(chǎn)量有所降低, 在30 g/L為100.84 mg/L。Li等[9]研究也發(fā)現(xiàn)了低質(zhì)量濃度氮源可促進(jìn)EPS產(chǎn)生,而高質(zhì)量濃度氮源抑制EPS產(chǎn)生,從而進(jìn)一步表明C/N對(duì)EPS的生產(chǎn)有著重要影響。因此,選用15 g/L的大豆蛋白胨質(zhì)量濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4　大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)植物乳桿菌YW11 EPS產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of soy peptone concentrations on yields of EPS from Lactobacillus plantarum YW11

2.1.5 接種量對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

接種量大小決定了微生物菌種在發(fā)酵過程中生長繁殖的速度,進(jìn)而影響EPS的產(chǎn)量。選用不同接種量的植物乳桿菌YW11(1%～6%)進(jìn)行發(fā)酵, EPS產(chǎn)量的結(jié)果見圖5。

圖5　接種量對(duì)植物乳桿菌YW11 EPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inoculum dose on yields of EPS from Lactobacillus plantarum YW11

由圖5可知,隨著接種量的增加,EPS的產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì),在接種量為3%時(shí),EPS的產(chǎn)量達(dá)到最大為45.04 mg/L,在接種量達(dá)到6%時(shí), EPS的產(chǎn)量為40.83 mg/L,介于最大值最小值之間。接種量過大,發(fā)酵前期會(huì)導(dǎo)致菌體生長過快,菌體濃度過高,發(fā)酵中后期會(huì)因營養(yǎng)物質(zhì)消耗而影響EPS的前體物質(zhì),從而降低EPS的產(chǎn)量；若接種量過小,則會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量不足,生長過程的延滯期拉長,細(xì)菌內(nèi)部某些維生素和輔酶等微量元素會(huì)與周圍環(huán)境發(fā)生過多的擴(kuò)散從而導(dǎo)致生長要素?fù)p失,細(xì)菌活性降低[10],因此選用接種量為3%進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.6 發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

溫度是影響微生物生長繁殖和EPS合成的重要因素,不同溫度下EPS的產(chǎn)量見圖6。

圖6　發(fā)酵溫度對(duì)植物乳桿菌YW11EPS產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperatures on yields of EPS from Lactobacillus plantarum YW11

由圖6可以看出,隨著發(fā)酵溫度的升高,植物乳桿菌YW11的EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在22℃時(shí),EPS的產(chǎn)量較低為41.08 mg/L,可能由于微生物多糖屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物,發(fā)酵溫度過低,微生物菌體生長緩慢,菌體質(zhì)量濃度不高,從而影響次生代謝產(chǎn)物EPS的含量。同時(shí),低溫會(huì)使類異戊二烯脂質(zhì)載體發(fā)生鈍化現(xiàn)象,也會(huì)導(dǎo)致EPS的產(chǎn)量降低。隨著發(fā)酵溫度的增加,EPS的產(chǎn)量逐漸增加,在32℃時(shí)達(dá)到最大為47.60 mg/L。但是隨著溫度繼續(xù)增加,EPS的產(chǎn)量出現(xiàn)下降趨勢(shì),在47℃時(shí)EPS產(chǎn)量最低為39.17 mg/L,這可能是由于發(fā)酵溫度過高,穩(wěn)定期提前到來,且溫度過高使得類異戊二稀脂質(zhì)載體失活等原因,導(dǎo)致多糖產(chǎn)量降低[11],因此選取最適發(fā)酵溫度為32℃。

2.1.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響如圖7。

圖7　發(fā)酵時(shí)間對(duì)植物乳桿菌YW11 EPS產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on yields of EPS from Lactobacillus plantarum YW11

從圖7可以看出,在植物乳桿菌YW11的生長期(6～18 h),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,EPS的產(chǎn)量增長速度較快,在18 h時(shí),EPS的產(chǎn)量達(dá)到最高為46.51 mg/L。然而,18 h后,EPS的產(chǎn)量呈現(xiàn)小幅度下降,隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長,EPS的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定,在36 h,EPS產(chǎn)量為44.48 mg/L。因此發(fā)酵時(shí)間選為18 h。Zhang等[12]和Wang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,植物乳桿菌C88和70810的EPS產(chǎn)量均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì),并推斷這可能是由于培養(yǎng)時(shí)間過久,培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分缺乏以及發(fā)酵后期細(xì)菌產(chǎn)生了可降解多糖的酶所致。

2.1.8 pH值對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基初始pH值是微生物在確定的發(fā)酵環(huán)境中代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo),pH值通過改變酶活性從而間接控制微生物的代謝。不同pH值下EPS產(chǎn)量的變化如圖8。

從圖8可以看出,在不同的pH值下,植物乳桿菌YW11 EPS的產(chǎn)量各不相同。在pH值為4時(shí), EPS產(chǎn)量較低,這可能是由于低pH值抑制了菌體的生長,從而影響EPS的分泌；在pH值6.0時(shí),EPS的產(chǎn)量達(dá)到最大為42.99 mg/L。研究表明,在pH 值5.8～6.2時(shí),乳酸菌EPS合成量最大,若pH值的降低,則會(huì)導(dǎo)致多糖的合成由于失去類異戊二烯脂中間體而受到阻礙[14]。Shu等[15]研究發(fā)現(xiàn),微生物產(chǎn)EPS的最適pH值在中性偏酸；此后,隨著pH值繼續(xù)升高,EPS產(chǎn)量降低較為顯著。因此,選取pH值6.0進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖8　pH值對(duì)植物乳桿菌YW11 EPS產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of pH on yields of EPS from Lactobacillus plantarum YW11

2.2 正交試驗(yàn)篩選發(fā)酵條件顯著性

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)影響植物乳桿菌產(chǎn)胞外多糖的6個(gè)因素(大豆蛋白胨質(zhì)量濃度、pH值、接種量、乳糖質(zhì)量濃度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度)進(jìn)行二水平正交設(shè)計(jì),結(jié)果如表1。

表1　二水平正交試驗(yàn)安排、EPS產(chǎn)量與極差分析Tab.1 Experimental design,results,and intuitive analysis of two-level orthogonal design

分析表明,各因素對(duì)EPS產(chǎn)量影響的重要性由大到小依次為大豆蛋白胨質(zhì)量濃度、pH值、接種量、碳源質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間。選取影響最顯著的3個(gè)因素(大豆蛋白胨質(zhì)量濃度、pH值、接種量)作為考察的重點(diǎn),通過響應(yīng)面法進(jìn)一步分析。

2.3 植物乳桿菌YW11產(chǎn)EPS主要影響因素的響應(yīng)面分析結(jié)果

根據(jù)BBD原理,設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。通過Design-Expert響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件分析,共有17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(見表2),以大豆蛋白胨質(zhì)量濃度、pH值、接種量3個(gè)因素為自變量,以EPS產(chǎn)量作為響應(yīng)值。

表2　Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Tab.2 Box-Behnken design and response values

2.3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c顯著性分析

將EPS的產(chǎn)量作為響應(yīng)值,Design-Expert響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件處理,各變量對(duì)響應(yīng)值的影響可由下列函數(shù)關(guān)系表示:

其中Y值表示EPS的產(chǎn)量,X1、X2、X3分別表示大豆蛋白胨質(zhì)量濃度、pH值、接種量3個(gè)因素。方差分析和各因素的顯著性如表3,在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi),模型的F值為119.79,影響顯著。函數(shù)的相關(guān)系數(shù)R2=0.932 8,R2值越接近1說明誤差的影響越小,表明該函數(shù)可以較好地模擬EPS的發(fā)酵過程。校正系數(shù)R2Adj為0.985 3,說明98.53%的響應(yīng)值變化可以用該模型來表示。失擬項(xiàng)的F=2.11,P =0.241 6＞0.05,即失擬不顯著,表明該函數(shù)關(guān)系式能充分反映實(shí)際情況。以上數(shù)據(jù)說明回歸方程的擬合程度良好。通過比較F值,可以看出不同因素對(duì)EPS產(chǎn)量的影響主次順序?yàn)?大豆蛋白胨質(zhì)量濃度、pH值、接種量。其中,X3和交互項(xiàng)X1X3、X1X2對(duì)EPS產(chǎn)量的影響作用顯著；X1、X2和X21、X22、X23對(duì)EPS產(chǎn)量影響極顯著。

表3　回歸方程的方差分析Tab.3 ANOVA analysis for regression equation

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析

圖9至圖11是由Design-expert 8.0.5b軟件分析得到的響應(yīng)面及等高線圖,分別表示X1、X2、X3中任意一個(gè)變量的水平固定為零時(shí),其余兩個(gè)變量對(duì)EPS產(chǎn)量的交互影響。等高線圖中,圓形表示兩個(gè)因素交互作用不顯著,橢圓表示這兩個(gè)因素交互作用顯著。

由圖9可看出,等高線圖呈現(xiàn)橢圓狀,表明大豆蛋白胨質(zhì)量濃度和pH值的交互作用顯著。將接種量固定為零,大豆蛋白胨質(zhì)量濃度設(shè)定為特定值時(shí),隨著pH值逐漸增大,EPS的產(chǎn)量先增加后減小,在pH值為6～7之間,達(dá)到最大。分析等高線圖中pH值和大豆蛋白胨等高線變化的密集度可知,大豆蛋白胨質(zhì)量濃度的等高線較為密集,大豆蛋白胨的質(zhì)量濃度對(duì)EPS的產(chǎn)量影響強(qiáng)度較pH值的影響大。隨著大豆蛋白胨的增加,EPS合成的原料也不斷增加,氮源過量,可能會(huì)打破原有的C/N,使植物乳桿菌的生長受到影響,從而導(dǎo)致EPS產(chǎn)量降低。同時(shí), 當(dāng)pH值發(fā)生改變時(shí),微生物生存所需的適宜C/N也有可能發(fā)生改變,這可能是pH值和大豆蛋白胨質(zhì)量濃度之間存在交互作用的原因之一[16]。

由圖10可以看出,等高線呈現(xiàn)橢圓狀,故大豆蛋白胨質(zhì)量濃度和接種量交互作用顯著。固定pH值為零,大豆蛋白胨質(zhì)量濃度固定,隨著接種量的增加,EPS的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),且從圖中可以看出,大豆蛋白胨的等高線比接種量的等高線密集,表明大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)EPS的產(chǎn)量影響較大。

由圖11可以看出,等高線接近圓形,表明pH值和接種量之間的交互作用不顯著,固定大豆蛋白胨的質(zhì)量濃度為零,當(dāng)pH值一定時(shí),隨著接種量的變大,EPS的產(chǎn)量先大后小。胞外多糖是次級(jí)代謝產(chǎn)物,一般都是在乳桿菌對(duì)數(shù)生長期末期和穩(wěn)定期產(chǎn)生,接種量過大,產(chǎn)量會(huì)下降,這可能與EPS吸附到產(chǎn)生菌菌體表面有關(guān)[17]。

圖9　pH值和大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)EPS產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface and contour plots for effects of pH and soy peptone concentrations on yields of EPS from Lactobacillus plantarum YW11

圖10　大豆蛋白胨質(zhì)量濃度和接種量對(duì)EPS產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.10 Response surface and contour plots for effects of soy peptone concentrations and inoculum dose on yields of EPS from Lactobacillus plantarum YW11

圖11　接種量和pH值對(duì)EPS產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.11 Response surface and contour plots for effects of inoculum dose and pH on yields of EPS from Lactobacillus plantarum YW11

由圖9～11中的響應(yīng)面立體圖中看出,響應(yīng)值Y存在最大值,該值越大說明發(fā)酵水平越高,結(jié)合穩(wěn)定值的性質(zhì),確定最大穩(wěn)定點(diǎn)。因此,最佳發(fā)酵條件為大豆蛋白胨質(zhì)量濃度13.50 g/L,pH=6.27,接種量為2.70%。帶入擬合的函數(shù)式,得到預(yù)測(cè)的EPS產(chǎn)量為129.915 mg/L。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用模型給出的條件進(jìn)行發(fā)酵,3次平行實(shí)驗(yàn)后取平均值,所得結(jié)果為131.26 mg/L,與預(yù)測(cè)值基本一致,說明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際的發(fā)酵情況。

3 結(jié) 論

本研究通過響應(yīng)面法,優(yōu)化了植物乳桿菌YW11產(chǎn)胞外多糖的條件,其高產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件為:大豆蛋白胨質(zhì)量濃度13.50 g/L、pH=6.27、接種量為2.70%。雖然每個(gè)單因素的最佳值與響應(yīng)面優(yōu)化后的得到的最優(yōu)值不匹配,但是,發(fā)酵因素之間的最優(yōu)組合可以較大幅度的提高EPS的產(chǎn)量,這說明發(fā)酵條件之間存在著一定的交互作用,它們共同影響植物乳桿菌的發(fā)酵過程。除此之外,改變發(fā)酵條件,胞外多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu),理化性質(zhì),圍觀結(jié)構(gòu)方面是否存在差異還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究表明,使用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件,較大幅度地提高了具有生物活性的植物乳桿菌YW11 EPS的產(chǎn)量,節(jié)省了發(fā)酵時(shí)間,提高了發(fā)酵效率,為其在酸奶、干酪及冰淇淋等發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯:李 寧)

Optimization of Fermentation Conditions of Lactobacillus Plantarum YW11 for Exopolysaccharides Production

CAO Yongqiang, WANG Ji, ZHAO Xiao, YANG Zhennai*
(School of Food and Chemical Engineering/Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Abstract:The fermentation conditions for producing exopolysaccharides by Lactobacillus plantarum YW11 isolated from Tibetan Kefir were optimized.The experiment factors and levels were firstly selected by the single-factor test.And then,the influences of significant factors were evaluated using a fractional factorial design.Using the yield of exopolysaccharides as the optimization index,a quadratic polynomial regression equation forecasting model was set up by designing a Box-Behnken design involving of three factors and three levels and the method of response surface analysis,thus the optimized extraction conditions were obtained.The optimized results by the single factor test showed that:fermentation time 18 h, carbon source of lactose(15 g/L),nitrogen source of soy peptone(15 g/L),fermentation temperature of 32℃,inoculation rate of 3%and pH of 6.0.The significant factors at the analysis range were:soy peptone,pH and inoculation rate,and the fermentation conditions optimized by response surface analysis were as follows:soy peptone concentration of 13.50 g/L,inoculation rate of 2.70%,and pH of 6.27.The exopoly saccharides yield under the optimal condition was 131.26 mg/L,near the theoretical value (129.915 mg/L).

Key words:Lactobacillus plantarum；exopolysaccharides；fermentation conditions；response surface analysis

作者簡介:曹永強(qiáng),男,碩士研究生,研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)；

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371804)；北京市教委科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(KZ201310011011)。

收稿日期:2015-03-25

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2016.01.007

文章編號(hào):2095-6002(2016)01-0042-08

中圖分類號(hào):TS201.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

引用格式:曹永強(qiáng),王輯,趙笑,等.植物乳桿菌YW11生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件研究[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2016,34(1):42-49.