新生期重復吸入七氟烷的成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ、Tau蛋白表達變化

劉富兵，馬歡歡，徐珊，張超，朱昭瓊

(1遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2貴州省麻醉與器官保護重點實驗室)

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新生期重復吸入七氟烷的成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ、Tau蛋白表達變化

劉富兵1，馬歡歡2，徐珊1，張超2，朱昭瓊2

(1遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2貴州省麻醉與器官保護重點實驗室)

目的觀察新生期重復吸入七氟烷對成年大鼠海馬組織CA3區(qū)β淀粉樣蛋白(Aβ)和異常磷酸化微管相關蛋白(Tau蛋白)的影響。方法取24只新生大鼠，隨機分為A、B、C組，每組各8只。分別于出生7、14、21 d時將各組大鼠置于自制麻醉劑箱中，連接麻醉機，A、B、C組分別吸入2.6%七氟烷、1.5%七氟烷、(1 L O2+l L空氣)/min，每次1 h，1次/d。待大鼠完全蘇醒后放回原籠，常規(guī)飼養(yǎng)至出生95 d(成年期)備用。出生 95 d檢測各組成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ和Tau蛋白。結果出生95 d時A、B、C組海馬組織CA3區(qū)Aβ蛋白的相對表達量分別為0.431±0.092、0.417±0.097、0.334±0.100，磷酸化Tau蛋白的相對表達量分別為0.434±0.055、0.456±0.059、0.410±0.060。A、B兩組海馬組織CA3區(qū)Aβ蛋白的相對表達量與C組相比，P均<0.05；B組海馬組織CA3區(qū)磷酸化Tau蛋白的相對表達量與C組相比，P<0.05。結論新生期重復吸入七氟烷可導致成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ和Tau蛋白表達升高。

七氟醚；成年，大鼠；海馬；CA3區(qū)；β淀粉樣蛋白；微管相關蛋白

目前，出生缺陷發(fā)病率逐年升高，外科手術是常用的治療方法。間斷、重復接受全身麻醉是否影響患兒成年后的學習記憶能力目前臨床尚無定論。β淀粉樣蛋白(Aβ)是大腦皮質老年斑的主要成分，微管相關蛋白(Tau蛋白)是Tau家族的主要成員,研究發(fā)現，Aβ和Tau蛋白是引起學習記憶能力下降的重要物質[1,2]。七氟烷是目前臨床常用的吸入麻醉藥，已廣泛用于嬰幼兒外科手術麻醉[3,4]。目前嬰幼兒期重復吸入七氟烷是否影響患者成年后記憶能力的報道較少。2013年7月～2015年1月，我們觀察了新生期重復吸入七氟烷的成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ和磷酸化Tau蛋白的表達情況，現報告如下。

1　材料與方法

1.1動物、藥物、試劑與儀器SPF級SD孕鼠30只由重慶第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供(許可證號：SCXK(渝)2007-0005),體質量300～400 g。待孕鼠自然分娩后選取7日齡大鼠24只，母乳喂養(yǎng)28 d。(動物飼養(yǎng)環(huán)境：相對溫度：50%～65%，環(huán)境溫度21℃±2℃，自然晝夜循環(huán)光照。七氟烷購自魯南貝特制藥有限公司，Aβ抗體、磷酸化Tau蛋白抗體購自英國Abcam公司，GTVIsionⅢ鼠/兔通用二抗檢測系統(tǒng)、氣體監(jiān)測儀購自德國Dragra公司，循環(huán)密閉吸入麻醉劑箱(78 cm×48 cm×15 cm)為本實驗室自制，箱底鋪約2 cm鈉石灰后覆蓋薄層紗布，顯微鏡熒光圖像分析系統(tǒng)購自德國Leica公司。

1.2大鼠分組及其新生期七氟烷吸入、飼養(yǎng)方法取24只新生大鼠，隨機分為A、B、C組，每組各8只。分別于出生7、14、21 d時將各組大鼠置于自制麻醉劑箱中，連接麻醉機，A、B、C組分別吸入2.6%七氟烷、1.5%七氟烷、(1 L O2+l L空氣)/min，每次1 h，1次/d。待大鼠完全蘇醒后放回原籠，常規(guī)飼養(yǎng)至出生95 d(成年期)備用。

1.3各組成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ、異常磷酸化Tau蛋白檢測采用免疫組織化學法。分別于出生 95 d時取各組大鼠，1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛經主動脈行腦灌注，斷頭處死大鼠后取出海馬組織，石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、酒精梯度復水、微波抗原修復、BsA封閉30 min后加入Aβ(1∶400)、磷酸化Tau蛋白抗體(1∶400)。4 ℃孵育過夜、復溫、生物素標記二抗、DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明，中性樹膠封片。PBS代替一抗作陰性對照。海馬組織染色后細胞核呈紫藍色，Tau蛋白、Aβ蛋白表達于海馬細胞胞質內。每區(qū)隨機取4個視野，應用Image-Pro Plus分析系統(tǒng)分析各組海馬CA3區(qū)Aβ、異常磷酸化Tau蛋白的光密度(MOD)值，以MOD值代表蛋白的相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

2　結果

出生95 d時A、B、C組海馬組織CA3區(qū)Aβ蛋白的相對表達量分別為0.431±0.092、0.417±0.097、0.334±0.100，磷酸化Tau蛋白的相對表達量分別為0.434±0.055、0.456±0.059、0.410±0.060。A、B兩組海馬組織CA3區(qū)Aβ蛋白的相對表達量與C組相比，P均<0.05；B組海馬組織CA3區(qū)磷酸化Tau蛋白的相對表達量與C組相比，P<0.05。

3　討論

七氟烷是新型吸入全麻藥，麻醉誘導快，且患者呼吸暫停發(fā)生率低、血流動力學也更為穩(wěn)定[5]。七氟烷可增強中樞神經系統(tǒng)內抑制性神經遞質GABA受體的效能，從而抑制維持覺醒的關鍵大腦核團的活性，最終導致意識消失[6,7]。

海馬是參與學習記憶和條件反射形成過程的重要部位。海馬沿錐體細胞系統(tǒng)分為四個區(qū)：CA1、CA2、CA3和CA4。CA1區(qū)和下托相連，含有小錐體神經元；CA3區(qū)是海馬水平部的背外側部分和垂直部的前內側部，含有苔蘚纖維和軸突[8]。海馬與學習記憶相關的兩個回路即Papez回路與三突觸回路[9]。三突觸回路中海馬CA1區(qū)與CA3區(qū)被認為與空間辨別性學習記憶活動的關系甚為密切[10]。有研究者選擇性的破壞小鼠海馬苔蘚纖維突觸與CA3區(qū)的錐體神經元的聯(lián)結區(qū)，破壞其信息位勢的分布格局，使保存在海馬神經網絡中的記憶信息很快消失，從而證實，海馬神經元的突觸與CA3區(qū)聯(lián)結是否正常，與學習記憶密切相關[12]。CA3區(qū)錐體細胞與門區(qū)神經元一樣，也是海馬致癲的易損細胞，錐體細胞死之后，苔蘚纖維的正常投射靶區(qū)消失，以致苔蘚纖維側支發(fā)芽至齒狀回內分子層。接著，CA3區(qū)錐體細胞將信息通過Schaffer側支突觸傳給CA1區(qū)，CA1區(qū)被認為是海馬的主要輸出區(qū)域。

MOD是通過比較光密度來反映陽性細胞所表達的蛋白的強度，其原理是根據細胞內不同化學成分的染色反應具有不同的吸收波長，并且化學反應在吸收值和細胞化學含量間存在一定的化學劑量關系的特點，衡量組織或細胞中某種成分的含量。TPA是以陽性反應的光密度值為設定條件，測定陽性染色面積為參數，通過比較陽性細胞所表達的面積比來實現的，分析陽性細胞蛋白表達的量的差異。這樣將陽性反應的強度與量結合，避免了平均光密度主觀性強，更客觀的分析測定。

研究表明，吸入麻醉藥可引起大腦內海馬皮層Tau蛋白過度磷酸化和β淀粉樣蛋白聚集，其病理改變在海馬形成老年斑(SP)和大量的神經原纖維纏結(NFTs)，并伴隨大量神經喪失，從而導致學習和記憶功能障礙[12]。β淀粉樣蛋白存在于正常大腦中，是一個產生、降解和清除的平衡過程。正常生理條件下，淀粉樣前體蛋白(APP)經非Aβ生成途徑代謝。新生期SD大鼠，在間斷、重復吸入臨床麻醉濃度與亞麻醉濃度七氟烷后，在病理狀態(tài)下，APP的非Aβ源加工途徑受抑制，Aβ途徑被激活，導致Aβ的生成過多及Aβ的降解和清除受抑制，最終導致Aβ的積聚，形成SP[13,14]。故吸入臨床麻醉濃度與亞麻醉濃度的七氟烷在CA3區(qū)的β淀粉樣蛋白聚積。由于APP基因具有突變或多態(tài)性，突變對細胞凋亡的發(fā)生起著重要作用，其中聚集性Aβ對神經細胞的毒性更大，并且可通過Aβ對神經元的直接作用而引起細胞的損傷。因此，Aβ具有很強的聚集性,易形成極難溶解的沉淀。所以推測在吸入臨床麻醉(2.6%)濃度的七氟烷在CA3區(qū)的β淀粉樣蛋白聚積，進而影響其學習記憶能力。Tau蛋白是含磷酸基的微管相關蛋白，正常情況Tau蛋白以磷酸化和去磷酸化兩種形式存在，處于一個平衡狀態(tài)，正常成熟腦中含2～3個磷酸基，在微管組裝中起著重要的作用，有利于正常成熟神經元軸突的完整性和穩(wěn)定性；過度異?；腡au蛋白含5～9個磷酸基，其引起主要病理改變?yōu)椋篢au蛋白變得異常磷酸化，采用非正常構象，在神經元中重新分布組合成不溶性、不能與微管結合的雙螺旋細絲(PHFs)，進而聚集成神經原纖維纏結(NFTs)。由于神經元纖維纏結的形成,破壞了神經元的正常物質轉運功能,進而阻斷神經元之間的突觸傳遞,最終導致神經元的損傷及死亡。相關研究發(fā)現[15]，小鼠海馬CA3 區(qū)錐體細胞NR1 亞基基因敲除后削弱了聯(lián)想回憶的能力,推測CA3區(qū)與聯(lián)想記憶有關(自聯(lián)想與異聯(lián)想)。本實驗吸入臨床麻醉濃度七氟烷后，CA3區(qū)Tau蛋白與對照組無異常，推測吸入臨床麻醉濃度的七氟烷并不影響自聯(lián)想與異聯(lián)想記憶。

綜上所述，新生期重復吸入七氟烷可導致成年大鼠海馬組織CA3區(qū)Aβ和Tau蛋白表達升高。提示在臨床上應避免對存在存在出生缺陷需重復進行外科手術的患兒重復采用七氟醚麻醉。

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國家自然科學基金項目(81360180)；貴州省科技廳聯(lián)合資金(黔科合J字LKZ〔2012〕04)；遵義市15851人才項目(FZL 1201412273)。

朱昭瓊(E-mail: 1625836721@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.009

R741

A

1002-266X(2016)27-0030-03

2015-12-16)