基于HPCE指紋圖譜的土鱉蟲質(zhì)量控制研究

張?jiān)露痍悅ロw羅文匯陳 昭（廣州番禺區(qū)中醫(yī)院，廣州，50000；廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣州，50095）

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基于HPCE指紋圖譜的土鱉蟲質(zhì)量控制研究

張?jiān)露?陳偉韜2羅文匯2陳 昭2
（1廣州番禺區(qū)中醫(yī)院，廣州，510000；2廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣州，510095）

摘要目的：在建立基于高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜的基礎(chǔ)上，建立更為全面、準(zhǔn)確的土鱉蟲藥材質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)方法；方法：采用毛細(xì)管電泳法（HPCE法），使用熔融硅膠毛細(xì)管（75 μm i. d.，總長(zhǎng)30 cm，有效長(zhǎng)度21 cm），以硼砂為緩沖液（10 mmol／L，pH 9. 7），進(jìn)樣電壓5 kv 10 s，分離電壓15 kv，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，建立不同批次、來源土鱉蟲藥材的指紋圖譜。根據(jù)所得指紋圖譜，找出其中的共有峰，并使用峰面積歸一化法計(jì)算各組分含量；結(jié)果：土鱉蟲藥材中存在7個(gè)共有峰，含量測(cè)定結(jié)果顯示，上述成分的含量在不同批次、來源藥材中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)論：該法快速、高效、準(zhǔn)確度高，精密度好，能夠更為全面、系統(tǒng)地評(píng)價(jià)土鱉蟲藥材的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞土鱉蟲；HPCE；指紋圖譜；質(zhì)量控制

Research of Quality Control of Ground Beetle by HPCE Fingerprint

Zhang Yue'e1，Chen Weitao2，Luo Wenhui2，Chen Zhao2
（1 Hospital of Traditional Chinese Medicine in Guangzhou Panyu District，Guangzhou 510000，China；2 Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital（Guangdong Provincial Engineering Technology Research Institute of T．C．M．），Guangzhou 510095，China）

Abstract Objective：To establish a comprehensive and precise method for quality control of Ground Beetle by the High Performance Capillary Electrophoresis（HPCE）；Methods：A fused silica capillary（75 μm i. d.，21 cm effective length，30cm total length）was used as column，borate solution was used as buffer solution（10 mmol／L，pH 9. 7），inject voltage was 5 kv 10 s，separation voltage was 15 kv and detection wavelength was 214 nm，common peaks were extracted from fingerprints of different batches and origins of Ground Beetle，and content of each compound was calculated by area normalization method. Results：Total seven peaks from the fingerprint were identified，and as the content determination result indicated，content of each compound had significant differences. Conclusion：HPCE is fast，efficient，accurate and precise，which can be used as a comprehensive and systematical method for quality control of Ground Beetle.

Key Words Ground Beetle；HPCE；Fingerprint；Quality control

1　資料與方法

1. 1 一般資料 土鱉蟲又名?蟲、地鱉蟲、土元。為鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphaga sinensis Walker或冀地鱉Stelephaga plancyi（Boleny）的雌蟲全體，為《中國藥典》收錄的傳統(tǒng)中藥品種，味咸，性寒，具有破瘀血，續(xù)筋骨的功效，中醫(yī)常用于筋骨折傷、瘀血經(jīng)閉、癥瘕痞塊［1-3］。土鱉蟲在我國境內(nèi)分布廣泛，其中地鱉分布于全國大部分地區(qū)；冀地鱉分布于河北、河南、陜西、甘肅、青海及湖南等地；此外，廣東、廣西等地還有金邊土鱉（特征為背殼邊緣呈金色）作為習(xí)用藥材使用。野生者在夏、秋季捕捉，人工飼養(yǎng)者隨時(shí)捕捉，捕到后用沸水燙死，曬干或烘干。近年來，隨著分析技術(shù)和分析方法的發(fā)展，圍繞土鱉蟲進(jìn)行的藥材鑒別、含量測(cè)定、活性成分提取分離等方面研究多有見諸報(bào)道［4-7］。

由于土鱉蟲為動(dòng)物來源的中藥材，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其含有的化學(xué)成分多為蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿或多肽類，其中多數(shù)成分尚處于結(jié)構(gòu)未知、功效不明的狀態(tài)。《中國藥典》2015版“土鱉蟲”項(xiàng)下僅收載了性狀、顯微鑒別與薄層鑒別；同時(shí)，由于土鱉蟲中多數(shù)成分存在分子量大、極性高或結(jié)構(gòu)相似等特征，HPLC等傳統(tǒng)分析技術(shù)僅能夠檢測(cè)其中少量小分子化合物，不能準(zhǔn)確反映該藥材與功效相關(guān)的質(zhì)量信息［8-10］。

高效毛細(xì)管電泳（High Performance Capillary E-lectrophoresis，HPCE）技術(shù)是在高壓電場(chǎng)作用下，帶點(diǎn)組分隨著電場(chǎng)方向遷移的一種分離分析方法［11-17］。由于這種分離在狹小空間內(nèi)進(jìn)行（25～200 μm內(nèi)徑，30～70 cm總長(zhǎng)的毛細(xì)管），加之緩沖液液流受電場(chǎng)推動(dòng)而呈平面型，故具有較高的柱效；此外，待測(cè)物在該模式下，由于帶電量的不同可導(dǎo)致遷移速率的差異，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)分離，且受分子量與極性影響相對(duì)較小，更有利于分析氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等傳統(tǒng)液相色譜難以分離的化合物。李峰等［18］報(bào)道了采用HPCE指紋譜對(duì)土鱉蟲藥材進(jìn)行鑒別研究，但目前為止，仍未見到基于該技術(shù)進(jìn)行的指紋圖譜含量測(cè)定研究。

1. 2 方法

1. 2. 1 儀器 毛細(xì)管電泳分析采用Agilent 3DCE高效毛細(xì)管電泳儀（美國Agilent公司），配備DAD檢測(cè)器及Chemstation工作站?；衔锝Y(jié)構(gòu)鑒定所用質(zhì)譜儀為Thermo TSQ Quantum（美國Thermo Fisher公司）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。稱量采用METTLER XS205DU型電子分析天枰（瑞士），pH測(cè)定采用METTLER TOLEDO pH計(jì)，超聲采用昆山科學(xué)儀器廠生產(chǎn)的超聲儀，毛細(xì)管購自河北永年瑞灃色譜器件有限公司。

1. 2. 2 試劑和試藥 緩沖液所使用的硼砂及調(diào)節(jié)pH的磷酸二氫鈉購自德國Sigma-Aldrich公司，土鱉蟲樣品分別購自廣東省各大醫(yī)藥公司，共兩個(gè)來源5批，所有樣品經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院劉法錦研究員鑒定為鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphaga sinensis Walker，金邊土鱉Opisthoplata Orientalis Buron或冀地鱉Stelephaga plancyi（Boleny）。

1. 2. 3 對(duì)照品和供試品的制備 對(duì)照品的制備方法為，精密稱取土鱉蟲對(duì)照藥材2 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入20%乙醇50 mL，加熱至微沸，回流1 h，過濾，取濾液蒸干，殘?jiān)?0%乙醇10 mL復(fù)溶，即得。

供試品的制備方法為，取土鱉蟲藥材2. 0 g，采用與對(duì)照品相同的方法處理，即得。

1. 2. 4 毛細(xì)管電泳分析 采用熔融硅膠毛細(xì)管（75 μm i. d.，總長(zhǎng)30 cm，有效長(zhǎng)度21 cm）；緩沖液：10 mmol硼砂（以磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH至9. 7），檢測(cè)波長(zhǎng)314 nm，進(jìn)樣電壓5 kv10 s，分離采用電壓梯度：0-15 min 5-15 kv，0-30 min15-20 kv，柱溫25℃。

2　結(jié)果

2. 1 方法學(xué)考察

2. 1. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性 分別精密稱取同一批次地鱉藥材0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10 g，分別置于100 mL圓底燒瓶中，按“1. 2. 3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1. 2. 4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，記錄各共有峰的總峰面積，計(jì)為y，已藥材取樣量為x，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝274. 89x-8. 149（r2＝0. 9995）。結(jié)果顯示，該方法線性良好，可在生藥量0. 1～10 g范圍內(nèi)對(duì)土鱉蟲中指標(biāo)性成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2. 1. 2 檢測(cè)限和定量限 精密吸取對(duì)照品溶液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋，按“1. 2. 4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，記錄各共有峰的峰面積。結(jié)果顯示，各主要峰的最低檢測(cè)限（LOD，S／N≥3）為0. 005 g生藥量，定量限（LOQ，S／N≥10）為0. 02，顯示該方法靈敏度良好。

2. 1. 3 精密度與回收率 精密度的測(cè)定方法為：取同一批的地鱉對(duì)照藥材2 g，精密稱定，按“1. 2. 3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1. 2. 4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，記錄總峰面積，連續(xù)測(cè)定6次，根據(jù)所得結(jié)果計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，6次測(cè)定中7個(gè)指標(biāo)性成分峰面積總和的精密度分別2. 3%，證明儀器精密度良好。

回收率的測(cè)定方法為：精密稱取已知含量的同批土鱉蟲藥材2 g 9份，記為低、中、高3個(gè)濃度組，每組3份。樣品分別按表1所述加入一定量的已知含量的地鱉對(duì)照藥材，按“1. 2. 3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1. 2. 4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，每份樣品平行測(cè)定三次，根據(jù)所測(cè)得指標(biāo)性成分的總峰面積計(jì)算回收率（結(jié)果見表1）。結(jié)果顯示，方法回收率良好，能夠?qū)ν流M蟲藥材進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

表1　回收率測(cè)定結(jié)果（n＝3）

2. 1. 4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批的土鱉蟲藥材6份，每份2 g，精密稱定，按“1. 2. 3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1. 2. 4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，記錄總峰面積，根據(jù)所得結(jié)果計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，6次測(cè)定中7個(gè)指標(biāo)性成分峰面積總和的精密度分別3. 1%，證明方法重復(fù)性良好。

2. 1. 5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批的土鱉蟲藥材2 g，精密稱定，按“1. 2. 3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1. 2. 4”項(xiàng)下方法，分別在0，1，2，4，6，8，12 h進(jìn)行測(cè)定，記錄總峰面積，根據(jù)所得結(jié)果計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，結(jié)果顯示，6次測(cè)定中7個(gè)指標(biāo)性成分峰面積總和的精密度分別2. 8%，證明供試品穩(wěn)定性良好。

2. 1. 6 不同批次、來源樣品的HPCE含量測(cè)定 取“1. 2”項(xiàng)下五批藥材，按“1. 2. 3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1. 2. 4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，選取指紋圖譜中響應(yīng)較大且共同存在的色譜峰作為監(jiān)控指標(biāo)峰。經(jīng)過與地鱉和冀地鱉對(duì)照藥材進(jìn)行比對(duì)，確定其中7個(gè)成分作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的候選指標(biāo)。之后，采用峰面積歸一化法，計(jì)算上述7個(gè)成分所占比例，結(jié)果見表2。

表2　不同批次、來源土鱉蟲含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

3. 1 HPCE條件優(yōu)化 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，樣品使用HPCE分離分析時(shí)，其峰響應(yīng)受溶劑、緩沖液種類與比例影響顯著；此外，分離電壓對(duì)指紋圖譜各峰分離度影響較大。因此，本研究對(duì)上述因素進(jìn)行了較為系統(tǒng)、全面的考察。

3. 1. 1 提取溶劑與緩沖液的影響 本研究選取水、20%乙醇溶液、50%乙醇溶液和100%乙醇溶液，對(duì)提取所得浸膏進(jìn)行復(fù)溶，復(fù)溶后進(jìn)HPCE分析，記錄各指標(biāo)峰峰面積。結(jié)果顯示，20%乙醇所得指紋圖譜響應(yīng)最高，干擾最小，故選用。緩沖液方面，本研究選取了硼砂及磷酸二氫鈉作為緩沖鹽。結(jié)果顯示，采用10 mmol硼砂-磷酸二氫鈉緩沖對(duì)（pH＝9. 7）時(shí)各峰分離度及響應(yīng)最佳；而單用磷酸二氫鈉時(shí)，待測(cè)樣品出峰較少，響應(yīng)較低。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因，可能是土鱉蟲藥材中所含氨基酸及多肽類成分多帶有酸性基團(tuán)，在磷酸二氫鈉所提供的弱酸性環(huán)境下無法解離所致。而硼砂溶液本身pH較高，也需采用磷酸二氫鈉調(diào)至弱堿性才有助于待測(cè)組分的解離。

3. 1. 2 分離電泳的考察 作為待測(cè)組分分離和運(yùn)動(dòng)的主要驅(qū)動(dòng)力，分離電壓也是HPCE指紋圖譜研究中的重要影響因素。本研究首先選取10、15、20、25、30 kV五個(gè)恒定電壓，對(duì)土鱉蟲對(duì)照藥材提取液進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，所得指紋圖譜中不同程度存在峰重疊或拖尾的現(xiàn)象，這可能與同一電壓下，不同化合物因帶電性相近而導(dǎo)致遷移速率相近有關(guān)。之后，經(jīng)優(yōu)化，選用了“2. 2”項(xiàng)下所述的電壓梯度，各組分得到了基線分離。

3. 2 結(jié)論 本研究采用HPCE法，建立了土鱉蟲藥材的指紋圖譜，并確定其中7個(gè)共有峰為質(zhì)量控制指標(biāo)性成分。該方法快速、高效、靈敏，質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)更為準(zhǔn)確、全面，為今后土鱉蟲及其他動(dòng)物類藥材的質(zhì)量控制提供了參考和借鑒。但是，由于目前尚未有更多土鱉蟲藥材中活性成分的報(bào)道，因此，在本研究的基礎(chǔ)上，還應(yīng)繼續(xù)深入對(duì)所測(cè)定的指標(biāo)峰進(jìn)行提取分離和結(jié)構(gòu)確證。

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（2015 -08 -10收稿 責(zé)任編輯：張文婷）

思路與方法

中圖分類號(hào)：R

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 042

通信作者：陳昭，Tel：（020）83482098，E-mail：cz20081331＠126. com

作者簡(jiǎn)介：張?jiān)露穑?973—），女，學(xué)士，主管技師，研究方向：主要從事生物指標(biāo)檢測(cè)診斷技術(shù)應(yīng)用研究，E-mail：364374130＠qq. com

基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研課題（編號(hào)：20141027）