回神顆粒減輕中度創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦內(nèi)炎性反應(yīng)的機制

崔俊波指導(dǎo)：陳寶貴（1中國中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動站，北京，100700；天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬武清中醫(yī)院，天津，301700）

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回神顆粒減輕中度創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦內(nèi)炎性反應(yīng)的機制

崔俊波1，2指導(dǎo)：陳寶貴2
（1中國中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動站，北京，100700；2天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬武清中醫(yī)院，天津，301700）

摘要目的：探討回神顆粒減輕中度創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury，TBI）后腦內(nèi)炎性反應(yīng)的作用環(huán)節(jié)。方法：應(yīng)用液壓性腦損傷裝置建立中度TBI模型，創(chuàng)傷壓力為（170±10）kPa，作用時間為（20±2）ms，隨機將大鼠分為6組：正常組、假手術(shù)組、模型3 d組、模型7 d組、治療3 d組、治療7 d組。治療3 d組和治療7 d組于創(chuàng)傷后即刻用2 mL藥液（含回神顆粒0. 27 g）灌胃1次，此后再分別于每日早晚各灌胃1次，每次2 mL藥液。采用RT-PCR檢測6組動物損傷區(qū)腦組織內(nèi)ICAM-1的變化。結(jié)果：與正常組比較：模型3 d組、模型7 d組、治療3 d組ICAM-1的表達(dá)明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0. 01）；治療7 d組ICAM-1的表達(dá)的升高無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0. 05）。治療3 d組ICAM-1的表達(dá)較模型3 d組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）；治療7 d組ICAM-1的表達(dá)與模型7 d組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）。結(jié)論：回神顆粒通過從轉(zhuǎn)錄水平抑制ICAM-1的表達(dá)，進(jìn)而減輕腦內(nèi)炎性反應(yīng)，避免TBI后腦損傷的進(jìn)一步加重。

關(guān)鍵詞創(chuàng)傷性腦損傷；繼發(fā)性腦損傷；腦內(nèi)炎性反應(yīng)；中性粒細(xì)胞；細(xì)胞間黏附分子-1；回神顆粒

The Mechanism of Huishen Granule Alleviating Intracerebral Inflammatory Response on Moderate Traumatic Brain Rats

Cui Junbo1，2，Chen Baogui2
（1 Post Doctoral Research Station in Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2 Wu Qing TCM Hospital Affiliated to Tianjin University of TCM，Tianjin 301700，China）

Abstract Objective：This research aims to investigate the mechanism of Huishen Granule alleviating intracerebral inflammatory response in rats with traumatic injury injury（TBI）. Methods：Using the equipment of fluid percussion injury（FPI）to establish moderate FPI model in SD rats. The traumatic pressure was（170±10）kPa，traumatic time was（20±2）ms. Randomly divided rats into 6 groups：normal group，sham group，model 3 day group，model 7 day group，experimental 3 day group，experimental 7 day group. Experimental 3 day group and experimental 7 day group were given 2 mL fluid（contain 0. 27 g Huishen Granule）into rats'stomach instantly after trauma，and then given 2 mL fluid in the morning and at night. Using real-time polymerization chain reaction（RT-PCR）to examine the change of ICAM-1 in all 6 groups. Results：Compared with normal group，the ICAM-1 of model 3 day group，model 7 day group and experimental 3 day group increased obviously（P＜0. 01）. However，compared with model 3 day group，the ICAM-1 of experimental 3 day group descended significantly（P＜0. 05）. Compared with model 7 day group，the ICAM-1 of experimental 7 day group declined obviously（P＜0. 05）. Conclusion：The mechanism of Huishen Granule alleviating intracerebral inflammatory response was through prohibiting the expression of ICAM-1 and avoid aggravation of TBI.

Key Words Traumatic brain injury；Secondary brain injury；Intracerebral inflammatory response；Polymorphonuclear leukocyte；ICAM-1；Huishengranule

腦內(nèi)炎性損傷在創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury，TBI）后繼發(fā)性腦損傷（Secondary Brain Injury，SBI）發(fā)展中的作用受到重視，炎性反應(yīng)參與腦創(chuàng)傷后SBI及損傷修復(fù)階段。TBI后腦內(nèi)炎性反應(yīng)的特征表現(xiàn)為腦內(nèi)中性粒細(xì)胞的出現(xiàn)、聚集和浸潤［1］。但由于血腦屏障的存在，循環(huán)中的中性粒細(xì)胞聚集和浸潤到損傷灶的腦組織內(nèi)，首先必須中性粒細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮，而這個過程需要黏附分子細(xì)胞間黏附分子（Intercellular Adhesion Molecule，ICAM）的表達(dá)上調(diào)［2］。故ICAM-1水平是評價顱腦損傷早期炎性反應(yīng)損傷程度的重要指標(biāo)，其變化水平與傷情嚴(yán)重程度密切相關(guān)［3］。本實驗采用中度TBI大鼠模型，觀察回神顆粒對中度TBI后ICAM-1含量的影響，探討回神顆粒減輕腦內(nèi)炎性反應(yīng)，避免TBI后腦損傷加重的作用環(huán)節(jié)。

1　材料與方法

1. 1 動物來源及分組 SPF級、雄性SD大鼠50只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2002-0003。體重（320±10）g，實驗大鼠于動物室內(nèi)分開籠中喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度為（17 ±3）℃，濕度為（50±20）%，每日光照12 h，并提供約50 g全營養(yǎng)鼠糧及足量清潔飲水。SPSS軟件隨機分為6組：正常組和假手術(shù)組各7只；模型3 d組、模型7 d組、治療3 d組、治療7 d組均為每組9只。

1. 2 主要儀器和試劑 主要包括：液壓顱腦損傷裝置、動物立體定位頭架、熒光定量PCR擴(kuò)增儀、凝膠圖像分析系統(tǒng)、熒光定量PCR主反應(yīng)液、胎牛血清等試驗器材及耗材。

1. 3 顱腦創(chuàng)傷模型的制作 參照崔俊波［4］等文獻(xiàn)中方法，應(yīng)用液壓性創(chuàng)傷性裝置（天津環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)外科研究所提供），調(diào)整打擊錘角度至12度，則產(chǎn)生的壓力大?。?70±10）kPa，作用時間為（20±2）ms，即可制作中度TBI模型，選取造模成功的動物進(jìn)入試驗環(huán)節(jié)。

1. 4 實驗處理方法 治療組：依據(jù)回神顆粒（天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院提供，制劑許可證號為：津XZ20010039）臨床應(yīng)用劑量：3次／d×10 g／次＝30 g／d，則標(biāo)準(zhǔn)體重大鼠劑量為30 g／d×0. 018＝0. 54 g／d，用4 mL生理鹽水稀釋成藥液，并于創(chuàng)傷后即刻用2 mL藥液灌胃1次，其后再分別于每日早晚各灌胃1次，2 mL／次藥液。模型組：用4 mL生理鹽水，分早晚2次灌胃。

1. 5 取材時間及方法 模型3 d組、治療3 d組于損傷后3 d處死動物；假手術(shù)組、模型7 d組、治療7 d組于損傷后7 d處死動物；正常組動物處死時間同假手術(shù)組。每組各取6只動物取腦。取腦方法：大鼠取俯臥位，沿顱頂正中線從枕后部直至鼻尖切開大鼠頭皮，暴露大鼠顱骨。用拆線剪在枕后橫斷頸椎，從椎管內(nèi)沿正中線向前剪開枕骨至后囟。再以拆線剪沿正中線剪開鼻骨、額骨至前囟，輕輕打開顱腔，暴露出大鼠腦組織。用剪刀輕輕將與腦組織相連的腦膜剪除。將鼠腦取出，選取損傷區(qū)腦組織約400 mg并立即投入液氮中，RT-PCR檢測時使用。

1. 6 RT-PCR檢測ICAM-1及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［5］取無菌留取的大鼠腦組織100 mg以Trizol一步法提取總RNA，采用熒光定量RT-PCR技術(shù)對逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。PRMER5. 0設(shè)計ICAM-1的引物序列，5'-GTGGGCAAGAACCTCATCCT 3'（正義鏈），5'-CTGGCGGCTCAGTGTCTCATT-3'（反義鏈），擴(kuò)增片斷約103 bp。在延仲過程中搜集熒光信號，于每次擴(kuò)增的同時設(shè)置無cDNA的陰性對照。結(jié)果由FTC-2000型熒光定量RT-PCR儀（上海，楓嶺生物技術(shù)有限公司）自帶分析軟件進(jìn)行分析。將ICAM-1的PCR擴(kuò)增片段回收，連接于PMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后再PCR鑒定，大量培養(yǎng)含陽性片段的重組克隆，減法提取重組質(zhì)粒并純化，測OD值計算濃度，并進(jìn)行倍比稀釋的熒光定量PCR，最終確定ICAM-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 7 統(tǒng)計學(xué)方法及數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 11. 5統(tǒng)計軟件。ICAM-1以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示。ICAM-1的2組間差異顯著性采用2個獨立樣本t檢驗。以P＜0. 05作為有無統(tǒng)計學(xué)意義的界限。

2　結(jié)果

2. 1 ICAM-1的擴(kuò)增曲線、融解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線 見圖1 -圖3。

圖1　ICAM-1的擴(kuò)增曲線

圖2　ICAM-1的融解曲線

2. 2 ICAM-1的數(shù)值結(jié)果 與正常組比較：模型3 d組、模型7 d組、治療3 d組ICAM-1的表達(dá)明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 01）；治療7 d組ICAM-1的表達(dá)的升高無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0. 05）。治療3 d 組ICAM-1的表達(dá)較模型3 d組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）；治療7 d組ICAM-1的表達(dá)與模型7 d組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）。

圖3　ICAM-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1　補氣化瘀開竅法對TBI大鼠ICAM-1mRNA的影響

3　討論

ICAM-1又稱CD54，是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一種單鏈跨膜糖蛋白。正常情況下中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，包括腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)的水平很低，但在神經(jīng)疾病中，由于多種炎性反應(yīng)遞質(zhì)和細(xì)胞因子以及應(yīng)激反應(yīng)、缺氧和缺血再灌注等因素刺激下，ICAM-1表達(dá)明顯升高［6］。Knoblach等［7］通過大鼠尾靜脈注射抗ICAM-1的抗體可以減輕外傷性炎性反應(yīng)，減少中性粒細(xì)胞的活性，促進(jìn)運動功能恢復(fù)。劉剛［8］等發(fā)現(xiàn)大鼠顱腦損傷后ICAM1表達(dá)隨時間變化，很可能在顱腦損傷修復(fù)中發(fā)揮重要功能，且對顱腦損傷的早期判定具有重要意義。本實驗發(fā)現(xiàn)兩個模型組及治療3 d組損傷區(qū)腦組織中的ICAM-1mRNA表達(dá)量均較正常組顯著增加（P＜0. 01），但兩個治療組損傷區(qū)腦組織中的ICAM-1mRNA表達(dá)量均明顯低于相對應(yīng)的模型組（P＜0. 05），且經(jīng)過應(yīng)用回神顆粒治療7 d后，治療7 d組損傷區(qū)腦組織中的ICAM-1mRNA表達(dá)量明顯降低，與正常組比較無顯著增加（P＜0. 01）。顯示TBI后早期應(yīng)用回神顆粒導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)腦組織中ICAM-1mRNA水平的表達(dá)顯著減少，表明回神顆粒能從轉(zhuǎn)錄水平抑制ICAM-1的表達(dá)，進(jìn)而減輕腦內(nèi)炎性反應(yīng)，避免TBI后腦損傷的進(jìn)一步加重。

現(xiàn)代藥理研究表明［9］：丹參能夠明顯改善微循環(huán)，加速血流；川芎在體外對由膠原和凝血酶誘導(dǎo)的家兔血小板聚集有顯著抑制作用，并可使已聚集的血小板迅速解聚，進(jìn)而阻止中性粒細(xì)胞堵塞微血管，避免血栓形成；五味子酚可使大鼠中性粒細(xì)胞表面的偽足和皺褶消失，減少中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞的附著和浸潤，而具有調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞功能的作用。既往研究證實回神顆粒能夠提高腦缺血大鼠模型腦組織SOD含量，降低MDA含量而減輕自由基對腦細(xì)胞的損害。故回神顆粒減輕TBI后損傷區(qū)腦組織中的炎性反應(yīng)所介導(dǎo)的SBI的機制可能包括：1）降低傷灶區(qū)腦組織中ICAM-1mRNA水平的表達(dá)，進(jìn)而減少傷灶區(qū)腦組織中的中性粒細(xì)胞的積聚和浸潤；2）改善微循環(huán)，阻止ICAM-1激活的中性粒細(xì)胞堵塞微血管，避免血栓形成；3）減輕ICAM-1激活的中性粒細(xì)胞釋放的大量自由基導(dǎo)致的腦損害。

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（2015 -06 -30收稿 責(zé)任編輯：王明）

針灸經(jīng)絡(luò)

中圖分類號：R285. 5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 036

作者簡介：崔俊波（1976—），男，漢族，河南鄭州人，醫(yī)學(xué)博士，全國首批中醫(yī)藥傳承在站博士后，天津市“131”創(chuàng)新型人才培養(yǎng)工程第一層次人選，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，陳寶貴名中醫(yī)工作室主任，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療腦病研究及名中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承應(yīng)用工作，Tel：（022）29338845轉(zhuǎn)7906，E-mail：clevertwins＠163. com

基金項目：全國名老中醫(yī)傳承工作室建設(shè)項目［編號：國中醫(yī)藥人教發(fā)（2011）41］；全國中醫(yī)藥傳承博士后資助項目［編號：國中醫(yī)藥人教函（2013）240號］；天津市“131”創(chuàng)新型人才第一層次人選培養(yǎng)工程［編號：津人才（2013）9］