液相芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷中的應(yīng)用＊

張立營(yíng)，劉國(guó)鳳，李克峰

綜述與講座

液相芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷中的應(yīng)用＊

張立營(yíng)，劉國(guó)鳳，李克峰＊

［摘要］液相芯片技術(shù)可以從少量樣本中快速得到大量的輔助診斷信息，正逐步從科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)室，在多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)、自身抗體篩查、人類白細(xì)胞抗原分型及感染性病原體基因檢測(cè)等方面具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)就液相芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用做一綜述。

［關(guān)鍵詞］液相芯片技術(shù)平臺(tái)；醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)；應(yīng)用

生物芯片主要包括基因芯片和蛋白芯片兩大類，按尋址方式和最終檢測(cè)載體又可分為固相芯片（flat microarrays）和液相芯片（liguid chip rmicrosphere arrays）。近年來(lái)，液相芯片技術(shù)（liquid chip technology，LCT）以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)及臨床實(shí)用性，正受到越來(lái)越多的重視，現(xiàn)就液相芯片的技術(shù)原理、特點(diǎn)及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面的臨床應(yīng)用做簡(jiǎn)要介紹。

1　液相芯片技術(shù)的定義

液態(tài)芯片是一種全新概念的生物芯片，又稱懸浮陣列、流式熒光技術(shù)，它是利用標(biāo)記的微球?yàn)榉磻?yīng)載體（最常用的標(biāo)記物為熒光染料），在不同的微球上固定有不同的探針?lè)肿樱ǖ鞍踪|(zhì)或核酸），不同的微球可通過(guò)熒光信號(hào)或大小進(jìn)行區(qū)分［1，2］。將這些微球混合后懸浮于液相體系中，與待檢分子充分反應(yīng)后，再加入合適的報(bào)告分子就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)，利用這個(gè)系統(tǒng)可以對(duì)同一樣品中的多個(gè)不同的分子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。液相芯片技術(shù)除了美國(guó)Luminex公司開(kāi)發(fā)的系列產(chǎn)品外，還包括在流式細(xì)胞儀平臺(tái)上進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)的微球芯片技術(shù)。目前應(yīng)用最為廣泛的為基于Luminex平臺(tái)的各種檢測(cè)應(yīng)用。目前基于該檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)已研發(fā)出數(shù)百種檢測(cè)應(yīng)用組合，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸及藥物等生物分子的檢測(cè)［3］。其中臨床診斷試劑的開(kāi)發(fā)方面也得到了快速發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物、人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）分型及自身免疫鑒別診斷等多重分析試劑已通過(guò)了美國(guó)食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）或中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）認(rèn)證，顯示出廣泛的臨床應(yīng)用前景［4，5］。本文主要基于Luminex液相芯片技術(shù)展開(kāi)討論。

2　Luminex液相芯片技術(shù)原理

Luminex液相芯片技術(shù)的核心是把微小的聚苯乙烯小球（5.6 μm）用熒光染色的方法進(jìn)行編碼，然后將每種顏色的微球（或稱為熒光編碼微球）共價(jià)交聯(lián)上針對(duì)特定檢測(cè)物的探針、抗原或抗體。應(yīng)用時(shí)，先把針對(duì)不同檢測(cè)物的編碼微球混合，再加入微量待檢樣本，在懸液中靶分子與微球表面交聯(lián)的分子進(jìn)行特異性地結(jié)合，在一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以同時(shí)完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)。最后用LuminexTM分析軟件進(jìn)行分析，儀器通過(guò)兩束激光分別識(shí)別編碼微球和檢測(cè)微球上報(bào)告分子的熒光強(qiáng)度。因?yàn)榉肿与s交或免疫反應(yīng)是在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測(cè)速度極快，而且可以在一個(gè)微量液態(tài)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多達(dá)100個(gè)指標(biāo)［6，7］。

3　Luminex液相芯片技術(shù)的發(fā)展與現(xiàn)狀

Luminex公司成立于1995年，總部位于美國(guó)德克薩斯州的奧斯汀，是一家專門致力于研發(fā)和生產(chǎn)生物化驗(yàn)分析儀器并將其運(yùn)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的公司。1999年第1代基于xMAP（flexible multi analyte profiling，xMAP）技術(shù)的Luminex100液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)誕生，可檢測(cè)100種生物分子，2005年升級(jí)推出Luminex 200液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)，于2007年推出了新一代液相芯片檢測(cè)平臺(tái)Flexmap 3D，F(xiàn)lexmap 3D更大地提高了檢測(cè)效率，可以同時(shí)對(duì)1個(gè)樣本中的500種不同目的分子進(jìn)行檢測(cè)，并且可以一次檢測(cè)384個(gè)不同樣本。2010年下半年推出磁珠專用的多重檢測(cè)系統(tǒng)——Magpix熒光生物反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)。Luminex公司采用類似開(kāi)發(fā)手機(jī)應(yīng)用的方式進(jìn)行技術(shù)推廣，即授權(quán)不同檢測(cè)試劑生產(chǎn)廠家發(fā)展基于xMAP技術(shù)的檢測(cè)應(yīng)用組合，包括Bio-Rad、Merck Millipore等行業(yè)知名的生物醫(yī)藥公司，推動(dòng)該技術(shù)廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析及受體與配體的識(shí)別分析等領(lǐng)域中，從而不斷擴(kuò)大Luminex液相芯片技術(shù)在基礎(chǔ)科學(xué)研究和臨床檢驗(yàn)診斷中的應(yīng)用［8，9］。截至2014年4月，利用Luminex技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行科學(xué)研究試劑研發(fā)的公司有24家，另外有34家公司利用此技術(shù)進(jìn)行臨床診斷試劑研發(fā)，其中也有部分中國(guó)的研究機(jī)構(gòu)或診斷試劑生產(chǎn)廠家。目前用于臨床檢測(cè)的項(xiàng)目主要有腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、病原體的快速篩查、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白檢測(cè)、激酶活性分析、過(guò)敏源篩查、激素和細(xì)胞因子檢測(cè)、基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)及代謝標(biāo)志物檢測(cè)等［10，11］。

4　Luminex液相芯片技術(shù)在臨床檢驗(yàn)診斷中的應(yīng)用

Luminex液相芯片技術(shù)的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：（1）檢測(cè)通量高。一次檢測(cè)可分析多個(gè)指標(biāo)，同時(shí)可以批量處理標(biāo)本。特別適合于需同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行臨床診斷的項(xiàng)目，如常用的多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物組合綜合篩查、自身免疫性疾病多種抗體篩查、TORCH檢測(cè)、呼吸道病毒多重篩查、HLA-DNA分型等，利用液相芯片技術(shù)可同時(shí)分析HPV的26種亞型，省去復(fù)雜的膜條雜交操作和主觀判斷的影響。（2）樣本用量少。25 μl樣本可檢測(cè)20個(gè)以上指標(biāo)，特別適于較難取材的標(biāo)本或量少的標(biāo)本如房水、腦脊液等標(biāo)本的檢測(cè)。（3）通用性廣。既可以檢測(cè)蛋白也可以檢測(cè)核酸。（4）檢測(cè)速度快且準(zhǔn)確性、重復(fù)性好。液相芯片多指標(biāo)聯(lián)檢的速度顯著高于常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和化學(xué)發(fā)光等檢測(cè)方法，同時(shí)由于反應(yīng)是在液相中進(jìn)行且每個(gè)指標(biāo)有1000-5000個(gè)微球反應(yīng)單元，依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理可以最大限度地減少誤差，極大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。（5）靈敏度高且線性范圍廣。液相芯片檢測(cè)的靈敏度是常規(guī)的ELISA方法靈敏度的10～100倍。檢測(cè)線性范圍可達(dá)3.5～5.0個(gè)數(shù)量級(jí)，是常規(guī)ELISA檢測(cè)方法的10倍以上。正是由于Luminex液相芯片技術(shù)的多種方法學(xué)優(yōu)勢(shì)，美國(guó)FDA批準(zhǔn)將液相芯片技術(shù)用于臨床檢驗(yàn)診斷［12，13］。2001年7月27日，基于Luminex xMAP技術(shù)的抗可提取核抗原抗體系列產(chǎn)品率先通過(guò)美國(guó)FDA的認(rèn)證。至2014年4月止，美國(guó)FDA共批準(zhǔn)了60個(gè)產(chǎn)品，近1000種指標(biāo)可應(yīng)用于臨床診斷，是近年來(lái)最受關(guān)注的臨床高通量檢測(cè)技術(shù)。國(guó)外液相芯片臨床診斷產(chǎn)品取得我國(guó)CFDA注冊(cè)證有HLA分型試劑和自身抗體系列篩查、TORCH、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體和類風(fēng)濕因子檢測(cè)試劑。值得一提的是我國(guó)診斷試劑廠家也取得Luminex公司授權(quán)研發(fā)相關(guān)臨床診斷產(chǎn)品，其中上海一家公司研發(fā)并取得CFDA注冊(cè)證的有15種腫瘤標(biāo)志物和HPV分型檢測(cè)試劑，另外廣州一家公司通過(guò)授權(quán)研發(fā)了表皮生長(zhǎng)因子受體檢測(cè)試劑。

5　液相芯片技術(shù)臨床應(yīng)用存在的問(wèn)題

雖然液相芯片技術(shù)具有傳統(tǒng)ELISA、時(shí)間分辨免疫熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，但大規(guī)模的臨床應(yīng)用尚有一定的距離［14-16］。其局限性表現(xiàn)在：（1）目前獲得CFDA批準(zhǔn)用于臨床診斷的項(xiàng)目或指標(biāo)目前還比較少，不能滿足臨床診斷的需求；（2）開(kāi)展液相芯片檢測(cè)項(xiàng)目必須購(gòu)置昂貴的Luminex液相芯片分析儀，一定程度上也制約了其臨床應(yīng)用；（3）對(duì)于蛋白質(zhì)檢測(cè)而言，Luminex液相芯片技術(shù)不可能達(dá)到理論上的檢測(cè)通量，因?yàn)殡S著檢測(cè)指標(biāo)的增多，抗體間的交叉反應(yīng)及相互干擾明顯增加。只有核酸分型才能達(dá)到Luminex檢測(cè)的多重極限；（4）目前尚未建立可靠的液相芯片檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)量控制及室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法以及關(guān)于液相芯片檢測(cè)項(xiàng)目相關(guān)的性能驗(yàn)證指標(biāo)；（5）就液相芯片技術(shù)本身而言，目前還沒(méi)有有效的手段來(lái)消除免疫測(cè)定中微球的非特異性吸附以及Hook效應(yīng)。

6　應(yīng)用展望

液相芯片技術(shù)平臺(tái)為臨床診斷中的多重指標(biāo)分析及批量標(biāo)本檢測(cè)提供了自動(dòng)化的檢測(cè)手段，正逐步從研究室進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)室，必將會(huì)在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、自身抗體檢測(cè)、HLA分型、HPV基因分型、細(xì)胞因子、傳染病檢測(cè)等方面得到極其廣泛的應(yīng)用?？梢灶A(yù)見(jiàn)，隨著微流體技術(shù)、數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)、光學(xué)信號(hào)處理技術(shù)及抗體技術(shù)研究的不斷深入，液相芯片技術(shù)在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)診斷方面將有著廣泛的應(yīng)用前景。

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［2015-08-19收稿，2015-09-17修回］［本文編輯：吳蓉］

Application of liquid chip technology in medical examination

ZHANG Li-ying①，LIU Guo-feng，LI Ke-feng.①The 2nd Sanatorium of Ji＇nan Military Command，Qingdao，Shandong 266071，China

［Abstract］The platform of liquid chip technology can get the diagnosis of a large amount of information from small samples fast，and it has great potential clinical application in the determination of autoimmune antibodies，muhitumor markers，the phenotype of Human Leukocyte Antigen and the genes of infectious pathogens.This article reviews the application of liquid chip technology in medical examination.

［Key words］Liquid chip technology platform；Medical examination；Application

［中圖分類號(hào)］R319

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［基金項(xiàng)目］青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（09-1-1-28-nsh）

［作者單位］266071山東青島，濟(jì)南軍區(qū)青島第二療養(yǎng)院檢驗(yàn)科（張立營(yíng)，李克峰）；266034山東青島，青島市婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科（劉國(guó)鳳）

［通訊作者］李克峰，Email：lkf808＠163.com

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.02.039