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      混合均勻設計法優(yōu)選金櫻子半仿生提取工藝

      2016-04-05 06:59:19趙惠茹
      中成藥 2016年1期
      關鍵詞:金櫻子

      趙惠茹, 劉 敏

      (西安醫(yī)學院藥學院,陜西西安710021)

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      混合均勻設計法優(yōu)選金櫻子半仿生提取工藝

      趙惠茹, 劉 敏

      (西安醫(yī)學院藥學院,陜西西安710021)

      摘要:目的 優(yōu)選半仿生法提取金櫻子的最佳工藝條件。方法 以3次煎煮用水的pH值和煎煮時間為考察因素,總黃酮、多糖、干浸膏得率為指標,應用混合均勻設計法優(yōu)選金櫻子半仿生提取的最佳工藝參數(shù)。結果 金櫻子半仿生提取最佳工藝為3次煎煮用水的pH依次為5、7.5、9,時間分別為2、1、1 h。結論 該工藝合理可行,可用于金櫻子的提取。

      關鍵詞:金櫻子;半仿生提??;混合均勻設計

      金櫻子又名刺榆子、糖刺果、刺橄欖等,為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx.的成熟果實,味酸、甘、澀[1]?,F(xiàn)代藥理研究表明[2],金櫻子果實可作為利尿劑、鎮(zhèn)咳劑,也常用于高血壓、慢性腎炎、燒燙傷、神經衰弱等疾病的治療。作為藥食同源的植物之一,金櫻子含有多糖、黃酮、酚酸、甾體、三萜類化合物等生物活性成分,其中多糖和黃酮類物質的含有量較高[3]。關于金櫻子多糖、黃酮類化合物提取的研究報道較多,大多采用正交試驗設計,以熱水浸提多糖、含水乙醇提取黃酮、酶化、超聲波、微波等方法同時提取這兩類成分[4-7],但當試驗中的因素和水平較多時,正交設計所需的試驗次數(shù)也較多,并且這些提取方法均未考慮到藥物在胃腸道的吸收情況。因此,本實驗采用可以提高藥物生物利用度的半仿生提取法[8-9],依次用不同pH的酸水和堿水進行提取,主要考察pH值及提取時間對金櫻子中多糖和黃酮類物質的影響。在試驗設計方面,均勻設計特別適用于多因素多水平的試驗設計,可用多重線性回歸分析方法準確、迅速地分析數(shù)據。到目前為止,采用混合均勻設計法優(yōu)選金櫻子的半仿生提取工藝尚未見報道,因此本實驗的目的在于為金櫻子的提取提供一條可參考的工藝路線,使其在藥食兩用領域的開發(fā)前景更加廣闊。

      1 儀器與材料

      1.1 儀器 PHS-3C型精密pH酸度計(上海精密科學儀器有限公司);UV-160A紫外分光光度計(日本島津公司);KQ5200E型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);FA1004B型電子天平(上海越平科學儀器有限公司);RE-201L旋轉蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司);DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);DHG-9240B電熱恒溫鼓風干燥箱(上海安亭科學儀器廠)。

      1.2 材料 D-無水葡萄糖(批號110833-200904)、蘆丁(批號100080-200707)對照品(中國食品藥品檢定研究院)。金櫻子購于西安市萬壽路藥材市場,并由邊軍昌高級實驗師鑒定為薔薇科植物金櫻子Rosa laevlgata Michx的干燥成熟果實。水為超純水;其他試劑均為分析純。

      2 方法與結果

      2.1 試驗設計 根據半仿生法提取的原理,將金櫻子粗粉先用酸水提取,然后用堿水提取,模擬口服給藥及藥物經胃腸道轉運的過程,以金櫻子總黃酮、多糖和干浸膏得率為指標,在藥材粒度(過40目篩)、提取溫度(100℃)、提取次數(shù)(3次)、過濾、濃縮等條件相同的情況下,確定3次煎煮用水的pH值和總時間為主要因素,各因素選取不同的水平,試驗設計見表1。

      表1 U9(91×33)試驗設計

      2.2 總黃酮含有量測定[10]

      2.2.1 蘆丁對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品

      21.4 mg,加適量無水乙醇溶解,定容于50 mL量瓶中,搖勻,得質量濃度為0.428 mg/mL的對照品貯備液。精密吸取5 mL,置于25 mL量瓶中,加無水乙醇至刻度,搖勻,即得質量濃度為85.6 μg/mL蘆丁對照品溶液。

      2.2.2 供試品溶液的制備及樣品中總黃酮含有量的測定將金櫻子果實干燥,碾碎,過40目篩,置于索氏提取器中,用石油醚回流提取至無色,藥渣干燥至恒重。精密稱取脫脂后干燥的金櫻子粉末約5 g,按表1方法進行試驗,每份樣品煎煮3次(料液比依次為12、8、6倍,3次提取時間比為2∶1∶1),提取液用4層紗布加100目篩分別濾過,3 000 r/min離心15 min,合并上清液,濃縮并定容至100 m L量瓶中,即得樣品溶液。取20 m L置于蒸發(fā)皿中,水浴蒸至近干,105℃下烘干,研勻,加80%乙醇15 mL,超聲提取30 min,濾過,定容于25 mL量瓶中,即得總黃酮的供試品溶液。精密吸取該溶液適量,加水逐級稀釋并定容于適當體積的量瓶中,再精密吸取此樣品溶液適量,置于10 mL量瓶中,測定金櫻子中總黃酮的含有量。

      2.2.3 標準曲線的制備與線性關系考察 精密吸取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,置于10 mL量瓶中,依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL,搖勻,放置6 min,加入10%三氯化鋁溶液0.4 mL,搖勻,放置6 min,再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL,用水稀釋至刻度,搖勻,放置15 min,在508 nm處測定吸光度。以對照品溶液質量濃度為橫坐標(C),吸光度為縱坐標(A)繪制標準曲線,得回歸方程A=0.016 2C+0.010 4(r=0.999 7),表明蘆丁在8.56~42.8 μg/mL范圍內線性關系良好。

      2.2.4 精密度試驗 精密吸取質量濃度為85.6 μg/mL的蘆丁對照品溶液3.0 mL,按“2.2.3”項下方法連續(xù)測定6次吸光度,計算出RSD值為0.26%(n =6),表明儀器精密度良好。

      2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量,按“2.2.3”項下方法操作,分別在0、2、4、6、8 h測定吸光度,計算出RSD值為1.78%(n =5),表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定。

      2.2.6 重復性試驗 取同一批金櫻子果實6份,按“2.2.2”項下方法制備樣品,按照表1中的7號試驗條件進行提取,“2.2.3”項下方法測定,計算含有量。結果,樣品中總黃酮含有量分別為35.9、36.3、37.2、37.8、36.9、35.1 mg/g,平均36.5 mg/g,RSD值為2.63%(n = 6),表明該方法重復性良好。

      2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取經石油醚脫脂、干燥至恒重、含有量已知的金櫻子粉末0.1 g,共9份,分別精密加入80%、100%、120%的蘆丁對照品各3份,按“2.2.2”項下方法制備樣品,按照表1中的7號試驗條件進行提取,“2.2.3”項下方法測定含有量。結果,平均回收率為96.89%,RSD為1.82%(n =9),表明該方法可行,準確性好。

      2.3 多糖含有量測定[11-12]

      2.3.1 葡萄糖對照品溶液的制備 精密稱取葡萄糖對照品26.91 mg,加適量蒸餾水溶解,定容于10 mL量瓶中,搖勻,得質量濃度為2.691 0 mg/mL的葡萄糖對照品貯備液,精密吸取2.5 mL于25 mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得質量濃度為0.269 1 mg/m L的葡萄糖對照品溶液。

      2.3.2 供試品溶液的制備及樣品中多糖含有量測定 精密吸取“2.2.2”項下3次水煎煮后的樣品溶液5 mL,加水稀釋,定容于量瓶中。再往3次水提后的殘渣中加水15 mL,置沸水浴中加熱回流30 min,趁熱過濾,殘渣用熱水洗滌,合并濾液,冷卻至室溫,轉移至25 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。精密吸取以上兩種樣品溶液適量,分別置于10 mL量瓶中,按照“2.3.3”項下方法測定其含有量,兩者之和即為總多糖的含有量,見表2。

      表2 各指標成分含有量及標準化處理結果

      2.3.3 標準曲線的制備與線性關系考察 精密量取對照品溶液0.0、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 m L,分別置于10 mL量瓶中,加純水稀釋至刻度,搖勻,分別吸取1 mL,置于對應編號的試管中,加6%苯酚1 mL、濃硫酸5 mL,搖勻,40℃水浴中保溫30 min,取出冷卻至室溫,在490 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(A),質量濃度為橫坐標(C)繪制標準曲線,得回歸方程A=0.011 0C+0.000 1(r=0.999 7)。結果表明,葡萄糖在16.15~69.96 μg/mL范圍內線性關系良好。

      2.3.4 精密度試驗 精密吸取葡萄糖對照品溶液1 mL,稀釋10倍,吸取1 mL置于試管中,苯酚-濃硫酸法顯色后,在490 nm處連續(xù)測定6次吸光度。結果,RSD值為0.17%(n =6),表明儀器精密度良好。

      2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取多糖供試品溶液2.2 mL,稀釋10倍,精密吸取1 m L置于試管中,苯酚-濃硫酸法顯色后,在0、2、4、6、8 h,490 nm處測定吸光度。結果,RSD值為2.92%(n =5),表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定性良好。

      2.3.6 重復性試驗 精密稱取脫脂后的樣品6份,按照表1中的7號試驗條件進行提取,按“2.3.2”項下方法制備多糖供試品溶液,分別精密吸取1 mL,稀釋100倍,按“2.3.3”項下方法測定吸光度,并計算含有量。結果,多糖的RSD值為1.94%(n =6),表明該方法重復性良好。

      2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取經石油醚脫脂、干燥至恒重、含有量已知的金櫻子粉末0.1 g,共9份,分別精密加入80%、100%、120%的葡萄糖對照品各3份,按照表1中的7號試驗條件進行提取,按“2.3.2”項下方法制備多糖供試品溶液,“2.3.3”項下方法測定所得多糖含有量之和。結果,平均回收率為97.34%,RSD為1.56% (n =9),表明該方法可行,準確性好。

      2.4 干浸膏得率的測定 精密吸取“2.2.2”項下樣品溶液各20 mL,置于恒定質量的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,105℃下烘至恒重,計算干浸膏得率。

      2.5 試驗結果與標準化處理 按照試驗建立的總黃酮、總多糖、干浸膏得率計算方法,測定每份樣品中這3個指標的數(shù)據,按公式Xij=(Xij-Xj)/Sj進行標準化處理(Xij為樣品液i中成分j的含有量;Xj為9個水平樣品液i中成分j的平均值;Sj為成分j的標準偏差;Xij為標準化后的值[13])。根據各指標在提取工藝中的主次地位,給予不同的加權系數(shù),Y=總黃酮含有量×4 +總多糖含有量×4 +干浸膏得率×2。以標準化后的值(表2中括號內的數(shù)字)加權后求和,即得綜合評價指標Y值,結果見表2。

      2.6 多元回歸方程的建立 將Y(綜合評價指標)用DPS 7.05軟件進行二次多項式逐步非線性回歸分析,得回歸方程Y=309.985 +168.174B-223.617C-0.522 381A2+ 20.780 6C2+0.435 729AB+0.590 236AD-18.499 4BC,r=0.999 9,F(xiàn)(7,1)=595.716 9。查F值表,F(xiàn)0.05(7,1)= 236.8,F(xiàn)>F0.05(7,1)(P<0.05)。F檢驗表明,回歸方程在a=0.05水平上有顯著意義;剩余標準差S =0.213 2,決定系數(shù)=0.999 7,說明此回歸方程具有良好的預測精度。數(shù)據模型因素的相關性分析見表3。

      由表3可知,各因素對綜合評價指標的影響程度為B= B×C>C2>A×D=C>A2>A×B,即第二煎pH值、第三煎pH值、第一煎pH值的二次項、第三煎pH值的二次項、第一煎pH值分別與第二煎pH值和提取時間的交互項、第二煎pH值與第三煎pH值的交互項均有顯著性影響。然后,應用DPS 7.05軟件將方程進行優(yōu)化,以綜合評價指標的期望值大者為佳,得優(yōu)化條件為A=5.1,B=7.5,C= 9,D=4,預測Y值為8.425。結合生產實際,確定金櫻子半仿生提取的最佳工藝,即三煎用水的pH分別為5.0、7.5、9.0,分別加12、8、6倍量水,煎煮時間分別為2、1、1 h。

      表3 數(shù)據模型因素的相關性分析

      2.7 驗證試驗 按照優(yōu)化的工藝條件,依據“2.2”~“2.5”項下樣品的制備和測定方法,進行3次驗證性試驗,測得各指標成分含有量,并將結果進行標準化處理。結果,總黃酮平均含有量為45.8 mg/g,總多糖平均含有量為303.52 mg/g,干浸膏得率平均值為38.06%,綜合評價指標Y′為8.262,與預測值(Y=8.425)比較接近,說明該提取工藝穩(wěn)定可行。

      3 討論

      由于金櫻子以黃棕至紅棕色的果實入藥,含有大量的脂類及脂溶性色素,而本實驗采用紫外可見分光光度法測定總黃酮和總多糖的含有量,為了使顯色反應更加靈敏,專屬性更強,在提取前藥材用石油醚連續(xù)回流提取,使脫脂更完全。

      在本實驗的操作過程中,用于測定多糖含有量的樣品包括兩部分,一部分來源于不同pH值提取的3次水煎液,而另一部分是由提取過黃酮的藥渣繼續(xù)用中性水提取得到。結果表明,第二部分所得多糖的含有量僅為第一部分的1.5%~3.8%,而金櫻子多糖的含有量非常高,故為了提高工作效率,可以省去藥渣的再次提取。

      表1的試驗設計是用pH值依次增大的蒸餾水連續(xù)3次煎煮藥材,這是由于人體胃、小腸、大腸的體液pH值分別為1.5~2.0、7.6、8.4,體現(xiàn)了半仿生提取法的特點。但根據實際情況,第二次和第三次煎煮的pH值以及時間在合理的范圍內細分為9個水平意義不大,故第一次煎煮的pH值設置了9個水平,而第二次和第三次煎煮的pH值以及時間只設置了3個水平。由此,在選擇均勻設計表時采用了U9(91×33)混合均勻設計表來安排試驗,可使試驗次數(shù)明顯減少,效率顯著提高。

      用混合均勻設計法優(yōu)選金櫻子半仿生提取工藝時,由于本實驗選用的總黃酮、總多糖和干浸膏得率等指標在提取工藝中的主次地位不同,因此在進行數(shù)據處理時,分別給予它們不同的權重系數(shù),將實驗數(shù)據進行標準化處理,得到綜合評價指標[14-15]。這樣,就可以消除各指標之間單位和量綱的不同,使實驗結果更加合理科學。

      參考文獻:

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      作者簡介:趙惠茹(1972—),女,碩士,副教授,從事天然藥物研究與開發(fā)。Te1:(029)86177548,E-mai1:wang- gq@chd.edu.cn

      基金項目:陜西省教育廳科研計劃項目(15JK1638);陜西省科技廳自然科學基金(2015JM8449)

      收稿日期:2014-10-21

      doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.048

      中圖分類號:R284.2

      文獻標志碼:B

      文章編號:1001-1528(2016)01-0197-04

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