甘草次酸微乳的制備及質(zhì)量評價

肖志偲， 趙瑞芝， 盧傳堅(jiān)

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006）

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甘草次酸微乳的制備及質(zhì)量評價

肖志偲， 趙瑞芝*， 盧傳堅(jiān)

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006）

摘要：目的 制備甘草次酸微乳，并對其性質(zhì)進(jìn)行考察。方法 HPLC測定甘草次酸的含有量；微孔酶標(biāo)測定濁度法繪制偽三元相圖；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選微乳處方。結(jié)果 甘草次酸微乳的最優(yōu)處方為聚氧乙烯40氫化蓖麻油（RH40）∶二乙二醇單乙基醚（Transcuto1P）∶油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafi1M 1944 Cs）∶純水=6.76∶2.25∶1∶14.37（質(zhì)量比）；微乳含藥量（3.00±0.06）mg/g；外觀澄清、透明且穩(wěn)定；平均粒徑（18.8±0.9）nm；多分散系數(shù)0.28±0.01；30℃恒溫下黏度（0.089±0.003）Pa.s；28℃下pH值5.75±0.10，15 000 r/min離心15 min后無分層現(xiàn)象。結(jié)論 該微乳制劑穩(wěn)定，可大幅提高甘草次酸的溶解度并顯著增強(qiáng)其生物利用度，有望作為甘草次酸的新型給藥制劑。

關(guān)鍵詞：甘草次酸；微乳；質(zhì)量評價；HPLC；微孔酶標(biāo)；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

甘草次酸（G1ycyrrhetinic acid，GA）是甘草中主要的三萜類活性成分甘草酸的苷元，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤和防癌作用［1］，由于其可抑制11β-羥基甾體脫氫酶的活性，也常用于銀屑病等皮膚疾病的治療［2-3］。然而，甘草次酸在水中的溶解性極差［4］，導(dǎo)致其生物利用度較低，從而限制了其臨床應(yīng)用。

微乳（micro emu1sion，ME）是由油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑通過適宜的配比，混合形成的粒徑小于100 nm、呈透明或半透明、低黏度、熱力學(xué)穩(wěn)定且各向同性的膠體分散體系［5-7］。與常規(guī)制劑相比，微乳可提高難溶性藥物在水中的溶解性，促進(jìn)藥物吸收，提高生物利用度。

本實(shí)驗(yàn)制備了甘草次酸微乳，并對其理化性質(zhì)及含有量進(jìn)行初步考察，期望利用新劑型來改善其溶解度和吸收特性，為將其開發(fā)成治療銀屑病的外用制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料 甘草次酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110723200612，供含有量測定用）；甘草次酸（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafi1M 1944Cs，法國Gattefosse公司）；肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、棕櫚酸異丙酯（IPP）（純度均＞98％，阿拉丁試劑上海有限公司）；聚山梨酯80（Tween 80，天津富宇精細(xì)化工有限公司，分析純）；聚氧乙烯35蓖麻油（EL-35）、聚氧乙烯40氫化蓖麻油（RH-40）（德國BASF公司）；聚乙二醇400（PEG400，天津大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；二乙二醇單乙基醚（Transcuto1P，法國Gattefosse公司）。甲醇為色譜純（天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；丙二醇為分析純（天津百世化工有限公司）；亞甲基藍(lán)、蘇丹紅Ⅲ（天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心）；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器 Agi1ent 1200高效液相色譜儀；恒溫?fù)u床（E25）；高速離心機(jī)（5430R）；渦旋混合儀（IKA）；超聲儀（USC-702）；電熱恒溫水浴鍋（DK-S26）；全波長酶標(biāo)儀（EonC）；多功能攪拌機(jī)（IKA）；黏度計(jì)（NDJ-1）；pH酸度計(jì)（De1ta-312 pH計(jì)）；電子天平（HTP-312）；Zeta-粒度測定儀（ZETA-1000HSA）。

2 方法

2.1 甘草次酸微乳處方確定

2.1.1 溶解度實(shí)驗(yàn) 將過量的甘草次酸分別加入到含有不同油相、表面活性劑、助表面活性劑的離心管中，37℃恒溫?fù)u床中水平振搖24 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液，適量甲醇稀釋，高效液相色譜法測定其濃度。

甘草次酸測定參考文獻(xiàn)［8］。采用Agi1ent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1％甲酸溶液，梯度洗脫（0～5 min，85∶15；5～12 min，100∶0）；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為248 nm；柱溫為27℃；進(jìn)樣量為5 μL。

2.1.2 表面活性劑和助表面活性劑的選擇 參照文獻(xiàn)［9-10］，將油相和混合表面活性劑按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的比例（質(zhì)量比）混合均勻成混合相。將各比例混合相按照A1200 μL、A2190 μL、A3180 μL至B810 μL加入96孔酶標(biāo)板孔中，然后將水相按A210 μL、A320 μL至B8190 μL、B9200 μL加入酶標(biāo)板孔中。渦旋震蕩10 min后，于酶標(biāo)儀630 nm波長下測定濁度，得到由澄清到混濁或者由混濁到澄清的臨界點(diǎn)體系。然后，根據(jù)臨界點(diǎn)繪制偽三元相圖，由微乳區(qū)域的面積大小來確定表面活性劑和助表面活性劑［11］。

2.1.3 Km值的選擇 將“2.1.2”項(xiàng)下的表面活性劑和助表面活性劑按照不同比例（即Km值）混合，加入一定量油相，按照“2.1.2”項(xiàng)下操作方法，根據(jù)臨界點(diǎn)繪制偽三元相圖，根據(jù)微乳區(qū)域大小確定Km值。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)處方優(yōu)化 以含水量（X1）及油相與混合表面活性劑的比值（O/S，X2）為自變量，選擇含藥量（Y1）、粒徑（Y2）、黏度（Y3）和濁度（Y4）作為因變量，采用2因素5水平進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化［12-14］。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定X1和X2極值范圍分別為46％～74％和0.11～0.67。各因素水平代碼值和實(shí)際值見表1。

表1　各因素水平代碼值和實(shí)際值

2.3 微乳含藥量測定方法 精密移取微乳1 mL至10 m L量瓶中，加3～5 mL甲醇超聲1 min進(jìn)行破乳，然后甲醇定容至10 mL，搖勻。取2 mL至4 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min。移取1 mL，0.45 μm濾膜過濾后，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，HPLC對樣品進(jìn)行含有量測定，平行操作3次，測定條件按照“2.1.1”項(xiàng)。

2.4 微乳理化性質(zhì)的考察

2.4.1 微乳類型鑒別 取等量制備的含藥微乳2份，分別加入等量紅色油溶性染料蘇丹紅或藍(lán)色水溶性染料亞甲藍(lán)，觀察兩者在微乳中的擴(kuò)散速度。

2.4.2 微乳黏度測定 取3批甘草次酸微乳樣品各一份，采用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)在恒溫下進(jìn)行黏度測定。

2.4.3 粒徑測定 取3批甘草次酸微乳樣品各一份，室溫條件下用水稀釋10倍后，激光粒度分析儀測定其粒徑。

2.4.4 穩(wěn)定性初步考察 將制得的甘草次酸微乳以15 000 r/min離心15 min，觀察有無分層現(xiàn)象。另取甘草次酸微乳3批，分別封存于5 mL西林瓶中，在相對濕度75％、溫度25℃條件下，放置0、1、3個月，觀察微乳是否保持澄清透明，有無油水分層現(xiàn)象。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果 以色譜峰面積（Y）對甘草次酸的質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=7.091 1X+ 11.258，r2=0.999 6，線性范圍為62.5～1 000 μg/mL。高、中、低濃度溶液日內(nèi)精密度RSD為0.15％、0.53％、0.33％；日間精密度RSD為0.05％、0.44％、0.78％。平均加樣回收率為98.2％，RSD值為1.68％。

3.2 處方篩選

3.2.1 油相的選擇 甘草次酸在各種輔料中的溶解度見圖1。由圖可知，甘草次酸在Labrafi1M 1944Cs中的溶解度最大，故為了提高微乳的載藥量，確定油相為Labrafi1 M 1944Cs。

圖1　甘草次酸在不同輔料中的溶解度（n=3）

3.2.2 表面活性劑和助表面活性劑的選擇 以油酸聚乙二醇甘油酯為油相，聚氧乙烯40氫化蓖麻油、聚氧乙烯35蓖麻油為表面活性劑，1，2-丙二醇、聚乙二醇400、二乙二醇單乙基醚為助表面活性劑，分別繪制偽三元相圖，見圖2。由圖可知，聚氧乙烯40氫化蓖麻油-二乙二醇單乙基醚組合的成乳區(qū)域最大，因此表面活性劑選擇聚氧乙烯40氫化蓖麻油，助表面活性劑選擇二乙二醇單乙基醚。

3.2.3 Km值的選擇 以油酸聚乙二醇甘油酯為油相，聚氧乙烯40氫化蓖麻油為表面活性劑，二乙二醇單乙基醚為助表面活性劑，在表面活性劑和助表面活性劑的質(zhì)量比分別為2∶1、3∶1、4∶1時繪制偽三元相圖，見圖3。由圖可知，當(dāng)Km為3時，微乳區(qū)域較大，故選擇表面活性劑：助表面活性劑=3∶1進(jìn)行處方優(yōu)化。

a.聚氧乙烯40氫化蓖麻油-二乙二醇單乙基醚 b.聚氧乙烯40氫化蓖麻油-1，2-丙二醇 c.聚氧乙烯40氫化蓖麻油-聚乙二醇400 d.聚氧乙烯35蓖麻油-二乙二醇單乙基醚 e.聚氧乙烯35蓖麻油-1，2-丙二醇 f.聚氧乙烯35蓖麻油-聚乙二醇400圖2　不同表面活性劑和助表面活性劑的偽三元相圖

圖3　不同Km值下的偽三元相圖

3.3 甘草次酸微乳處方優(yōu)化 以水相百分含有量X1（％）、油相/混合表面活性劑（O/S）X2為自變量，微乳含藥量Y1、粒徑Y(jié)2、黏度Y3、濁度值Y4為因變量，利用Design-expert8.0.6軟件得到不同的處方。再稱取處方量混合相成分，加入適量藥粉，溶解至肉眼看不見藥粉，再加入水相攪拌成乳。對各組合乳劑進(jìn)行含量、粒徑、黏度以及濁度測定，平行操作3次。結(jié)果見表2。

經(jīng)線性及非線性回歸處理后，粒徑、濁度與O/S呈多元線性關(guān)系，隨著O/S值增大而增大，而且受含水量影響較?。火ざ扰cO/S呈非線性關(guān)系，含水量對其影響較大，在大于60％時變化較小。含藥量符合二次多項(xiàng)式模型，進(jìn)行二項(xiàng)式擬合（r2=0.998 9，P=0.000 3），得方程Y1= +9.313 45 -0.111 52X1（％）-4.769 66X2（O/S）+ 0.045 000X1（％）X2（O/S）+1.812 50×10-4X21（％）+1.265 63X22（O/S）。經(jīng)優(yōu)化，水相百分含有量X1= 58.93％，油相和混合表面活性劑的比例（O/S）X2= 0.111，預(yù)測值載藥量3.04 mg/g，粒徑20.6 nm，黏度0.1 Pa.s，濁度值0.04。因此，甘草次酸微乳的最優(yōu)處方為聚氧乙烯40氫化蓖麻油∶二乙二醇單乙基醚∶油酸聚乙二醇甘油酯∶純水的比例為6.76∶2.25∶1∶14.37（質(zhì)量比）。

表2　試驗(yàn)中各因素的實(shí)際值以及各因變量結(jié)果

3.4 甘草次酸微乳的制備及含有量測定 根據(jù)優(yōu)化處方，稱取處方量的聚氧乙烯40氫化蓖麻油、油酸聚乙二醇甘油酯、二乙二醇單乙基醚，攪拌混合均勻后，加入甘草次酸藥粉，待其溶解后慢慢滴加水相，勻速攪拌，得到澄清透明的甘草次酸含藥微乳。平行制備3份，進(jìn)行含有量測定，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，測得微乳載藥量為（3.00± 0.06）mg/g。

3.5 微乳性質(zhì)考察 在微乳類型鑒別中發(fā)現(xiàn)，水溶性染料亞甲藍(lán)的擴(kuò)散速度比油溶性染料蘇丹紅快，表明本品為O/W型微乳。30℃恒溫下的黏度為（0.089±0.003）Pa.s；28℃下pH值為（5.75±0.10）；3批樣品的平均粒徑為（18.8±0.9）nm；多分散系數(shù)為（0.28±0.01），說明微乳粒徑小，而且分布均勻，以15 000 r/min離心15 min，無分層現(xiàn)象，仍均一澄清。在相對濕度75％、溫度25℃條件下，將該微乳放置0、1、3個月，發(fā)現(xiàn)仍保持澄清透明，未見油水分層現(xiàn)象。

4 討論

偽三元相圖是微乳制備的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用微孔酶標(biāo)儀測定法繪制偽三元相圖，臨界點(diǎn)測定時可多個處方同時進(jìn)行，臨界突變點(diǎn)能夠通過測定濁度值客觀得到，比傳統(tǒng)的目測滴定法更快速準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)效率顯著提高。通過對優(yōu)化處方進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，實(shí)測值與預(yù)測值基本相符，提示本實(shí)驗(yàn)處方優(yōu)化方法是可行的。

藥物的溶解度能夠影響藥物制劑的開發(fā)和藥物的生物利用度。微乳作為一種新型的藥物載體，能夠提高難溶性藥物的溶解度［15］，它對藥物的增溶作用取決于其組成成分混合表面活性劑、油相和水相對藥物的溶解能力。在本實(shí)驗(yàn)中，甘草次酸為水難溶性成分，故混合表面活性劑和油相對于甘草次酸的溶解至關(guān)重要。因此，選擇對甘草次酸溶解性比較好的聚氧乙烯40氫化蓖麻油、二乙二醇單乙基醚以及油酸聚乙二醇甘油酯分別作為微乳的表面活性劑和油相。然后，對甘草次酸微乳藥物的含有量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)是其在水中溶解度（0.008 5 mg/g，自測值）的352倍，大幅提高了溶解性，提示微乳作為甘草次酸載體，有望顯著改善其生物利用度，從而提高療效。

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doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.045

中圖分類號：R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0187-04

*通信作者：趙瑞芝（1968—），女，研究員，博士生導(dǎo)師，從事藥物新劑型及其相關(guān)技術(shù)研究。Te1：13610241754，E-mai1：13610241754@163.comD

作者簡介：肖志偲（1989—），女，碩士，從事藥物新劑型及其相關(guān)技術(shù)研究。Te1：15989078630，E-mai1：xzc89152@163.com

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（S2013030011515）；廣東省科技廳-廣東省中醫(yī)院聯(lián)合專項(xiàng)項(xiàng)目（2011B032200009）；廣東省中醫(yī)院項(xiàng)目（YK2013B1N11）

收稿日期：2014-09-01