蔡洪敏 王業(yè)勝 許國鳳 李黃金 趙 林(廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 廣州510006)
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腹水型抗EGF R單克隆抗體純化方法的研究△
蔡洪敏王業(yè)勝許國鳳李黃金趙林*(廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院廣州510006)
摘要:目的:研究腹水型抗EGFR單克隆抗體的純化方法。方法:抗EGFR雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水,經(jīng)離心預(yù)處理,上清先用PEG6000沉淀,沉淀物溶解再用Protein-A柱親和純化,SDS-PAGE鑒定純化效果。結(jié)果:經(jīng)兩步純化,抗EGFR單抗純度達(dá)到了98%以上,收率達(dá)到90%以上。結(jié)論:PEG6000沉淀和Protein-A柱親和層析相結(jié)合,是純化腹水型單抗體的一種高效方法。
關(guān)鍵詞:腹水EGFR單克隆抗體純化
表皮生長因子受體(epidermical growth factor receptor,簡稱為EGFR)是當(dāng)前腫瘤治療的熱門靶點(diǎn),采用單克隆抗體封閉EGFR信號通路,以抑制EGFR過表達(dá)或突變的腫瘤細(xì)胞的生長,是治療EGFR相關(guān)腫瘤的一種主要策略[1]。我們在前期研究中,發(fā)現(xiàn)了EGFR二聚化界面的一個(gè)腫瘤B細(xì)胞表位肽[2],針對該表位制備了特異性的抗EGFR單克隆抗體。為詳細(xì)研究該單抗的功能,本文研究其純化方法。
1.1材料與試劑:抗EGFR小鼠腹水由本實(shí)驗(yàn)室制備,-20℃凍存?zhèn)溆?;PEG6000:上海翊圣生物公司;Protein-A親和層析預(yù)裝柱(5mL):北京康為世紀(jì)公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒:北京鼎國昌盛公司;低分子量蛋白Marker:大連寶生物公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1腹水預(yù)處理:將-20℃凍存的抗EGFR腹水于4℃解凍過夜,4℃,10000×g離心15min,吸棄表層油脂,上清于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2采用PEG6000進(jìn)行粗分離:取上清置于冰上,加入等體積預(yù)冷的20mM磷酸鹽緩沖液,攪拌均勻。邊攪拌邊緩慢加入預(yù)冷的濃度為30%的PEG6000溶液,至終濃度為10%。冰上放置1h后,8000rpm離心20min,棄上清,收集沉淀。沉淀用適量含300mM NaCl,pH8.0,20mM磷酸鹽緩沖液溶解成蛋白濃度約為1mg/mL的溶液。
1.2.3采用Protein-A柱進(jìn)行精細(xì)純化:Protein-A柱用含300mM NaCl,pH8.0的20mM磷酸鹽緩沖液流洗5~10個(gè)柱床體積,以平衡柱子。將上一步溶解的樣品上柱,速度控制在2mL/min。以平衡緩沖液沖洗柱子5~10個(gè)柱床體積,至基線平穩(wěn)。用pH4.0 的0.1M檸檬酸鈉緩沖液洗脫,收集洗脫峰樣品,用pH9.0的1M Tris-HCl中和緩沖液將洗脫峰樣品中和至中性。用5~10個(gè)柱床體積平衡緩沖液平衡柱子至中性。
1.2.4樣品濃度及純度測定:用BCA蛋白濃度測定試劑盒分別測定腹水、PEG6000粗分離產(chǎn)物、Protein-A柱精細(xì)純化產(chǎn)物的濃度,用SDS-PAGE分析各樣品中抗EGFR單抗的純度。
2.1純化結(jié)果:預(yù)處理后的腹水樣品經(jīng)PEG6000沉淀后,單抗被選擇性沉淀下來,在上清中幾乎沒有殘留,同時(shí)白蛋白等主要雜蛋白被留在上清中,PEG6000很好地實(shí)現(xiàn)了粗分離,如圖1所示。經(jīng)凝膠掃描軟件分析,粗分離后單抗的純度達(dá)到85%以上。粗分離的單抗經(jīng)Protein-A柱純化后,洗脫峰樣品中幾乎無雜質(zhì),經(jīng)凝膠掃描軟件分析,純度達(dá)到98%以上,如圖2所示。
2.2純化收率和純度:經(jīng)凝膠掃描分析軟件分析,PEG6000粗分離樣品的純度達(dá)到85.6%,Protein-A柱精細(xì)純化后,抗體的樣品純度達(dá)到98%以上。PEG6000沉淀分離后,目標(biāo)產(chǎn)物的收率達(dá)到91%,Protein-A柱親和層析后,收率達(dá)到89%,兩步純化的總收率達(dá)到80.99%,收率較高。
單抗的純化是進(jìn)行抗體功能研究的前一步。在目前的純化方法中,有鹽析法、親和純化法、透析法,純度往往達(dá)不到應(yīng)用要求[3,4]。在本研究中,PEG6000具有很好的沉淀選擇性,10%的PEG6000很好地沉淀了單抗而將大量的主要雜蛋白即白蛋白留在上清中。這一步的純化為后一步Protein-A柱的親和層析,減輕了上樣負(fù)擔(dān),增加了純化的效率。本研究的兩步純化法純化單抗,既有高的純度又有高的回收率,是純化單抗一種行之有效的方法。
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△項(xiàng)目來源:廣東藥學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(1057313025);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020210027);廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015A030310120)。
*通訊作者
中圖分類號:R73
文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B
文章編號:1672-8351(2016)01-0098-01