不完全型雄激素不敏感綜合征產(chǎn)前診斷研究*

吳維青 文華軒 袁 暉 謝建生**

1. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室（深圳 518032）；

2. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院超聲科；3. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院產(chǎn)科

·論 著·

不完全型雄激素不敏感綜合征產(chǎn)前診斷研究*

吳維青1文華軒2袁 暉3謝建生1**

1. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室（深圳 518032）；

2. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院超聲科；3. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院產(chǎn)科

目的對(duì)不完全型雄激素不敏感綜合征（Partial Androgen Insensitivity Syndrome, PAIS）一家系進(jìn)行病例報(bào)道及遺傳分析，并對(duì)高危胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。方法分析患者雄激素受體（AR）基因序列及第一外顯子內(nèi)的CAG重復(fù)，結(jié)合核型及產(chǎn)前超聲判斷胎兒是否罹患PAIS。結(jié)果2名患者AR基因編碼區(qū)及側(cè)翼序列未見(jiàn)異常，男性胎兒獲得了與疾病相關(guān)的CAG重復(fù)次數(shù)，超聲檢查提示其外生殖器發(fā)育異常。結(jié)論本研究對(duì)一個(gè)PAIS家系進(jìn)行了遺傳分析，雖未能明確AR基因突變，但連鎖分析及產(chǎn)前超聲均提示男性胎兒罹患PAIS。本研究可為同樣病例的遺傳分析、產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢提供借鑒資料。

不完全型雄激素不敏感綜合征；雄激素受體基因；產(chǎn)前診斷；連鎖（遺傳學(xué)）

Key woordspartial Androgen Insensitivity Syndrome（PAIS）；androgen receptor gene；prenatal diagnosis；Linkage （Genetics）

雄激素不敏感綜合征（ardrogen insenstivity syndromes, AIS）是由位于Xq11.12的雄激素受體基因（androgen receptor，AR）突變所致的X連鎖隱性遺傳病，根據(jù)表型輕重可分為完全型雄激素敏感綜合征（complete androgen insensitivity syndrome, CAIS）和不完全型雄激素敏感綜合征（partial androgeninsensitivity syndrome, PAIS, MIM #312300）。PAIS患者為男性，但具有程度不等的外生殖器發(fā)育異常（陰莖短小、尿道下裂）、生育功能低下、乳房發(fā)育等女性第二性征。PAIS發(fā)病率低于CAIS，但具體的發(fā)病頻率尚不清楚［1］。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，已報(bào)道的引起PAIS的AR基因（CAG）突變已超過(guò)100多種［2］，主要位于編碼AR蛋白非關(guān)鍵功能區(qū)域內(nèi)。同一種突變?cè)诓煌蚁祵?dǎo)致的臨床表現(xiàn)輕重程度可明顯不同，攜帶同一突變的同一家系成員臨床表現(xiàn)也不盡相同。鑒于經(jīng)典基因突變檢測(cè)一般僅局限于外顯子及側(cè)翼序列等多種原因，并非所有AIS疑似患者均能檢測(cè)到AR基因突變［3］。AR基因第一外顯子內(nèi)存在一個(gè)CAG三核苷酸重復(fù)，其重復(fù)次數(shù)的增加與脊髓延髓肌肉萎縮癥、乳腺癌、前列腺癌、子宮及內(nèi)膜癌、男性不育等多種疾病相關(guān)［4,5］。CAG重復(fù)次數(shù)范圍在人群中呈明顯的多態(tài)性，且具有種族差異，中國(guó)人此位點(diǎn)亦呈明顯的多態(tài)性［6］，有研究表明中國(guó)漢族人群CAG重復(fù)具有高度的遺傳多態(tài)性（雜合度為0.833，多態(tài)信息量為0.88）［7］，屬于較好的連鎖分析標(biāo)志。

國(guó)內(nèi)已有一些關(guān)于CAIS患者AR基因突變的報(bào)告［8,9］，但對(duì)PAIS，卻只有少數(shù)病例報(bào)告［10-12］及尿道下裂患者AR基因突變研究［13］。本研究對(duì)一個(gè)典型的PAIS家系的2名患者進(jìn)行AR基因突變檢測(cè)，綜合利用連鎖分析、遺傳學(xué)性別鑒定及產(chǎn)前超聲檢查明確胎兒是否罹患PAIS，為同類病例的遺傳學(xué)診斷及遺傳咨詢提供借鑒資料。

資料與方法

一、研究資料

一個(gè)PAIS家系（見(jiàn)圖1），共有5名患者，呈現(xiàn)典型X連鎖隱性遺傳特征。先證者（Ⅳ7），男，7歲，出生時(shí)即發(fā)現(xiàn)陰莖短小、尿道下裂，于2歲時(shí)行尿道成形術(shù)，染色體核型為46, XY。先證者舅舅（Ⅲ5），男，34歲，出生時(shí)也有陰莖短小、尿道下裂，行陰莖成形矯正手術(shù)后可勃起；精液分析提示少精子、死精子；未能生育子女；多次因乳房發(fā)育行乳腺組織切除手術(shù)；其性激素6項(xiàng)檢查結(jié)果顯示睪酮（T）、雌二醇（E2）及促黃體生成素（LH）偏高，具體數(shù)值為：T 8.45μg/L（1.75～7.81）、孕酮（P）1.16μg/L（0.14～2.06）、E265pg/mL（20～47）、泌乳素（PRL）5.06μg/L（2.64～13.13），LH 13.90IU/L（1.24～8.6）、促卵泡生成素（FSH）12.43IU/L（1.3～19.3）；染色體核型為46, XY。家系中其他患者均有類似情況，且均未能生育子女。家系遺傳方式、患者的臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查符合PAIS的診斷。先證者母親（Ⅲ6），31歲，孕11周時(shí)來(lái)我院就診，要求進(jìn)行基因診斷和產(chǎn)前診斷，簽署知情同意書(shū)，于孕17周行羊水穿刺術(shù)。

二、方法

1．DNA提取：外周血及羊水標(biāo)本，以QIGEN試劑盒提取基因組DNA。

2．AR基因突變檢測(cè)：根據(jù)AR基因序列，應(yīng)用primer 5 軟件自行設(shè)計(jì)引物，對(duì)2名患者AR基因8個(gè)外顯子及測(cè)序序列進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)外顯子1內(nèi)CAG重復(fù)次數(shù)。

3．CAG重復(fù)連鎖分析：根據(jù)AR基因exon1序列，參考文獻(xiàn)［14］設(shè)計(jì)包含重復(fù)序列的一對(duì)引物，正向引物以熒光標(biāo)記，產(chǎn)物于CEQ8000遺傳分析儀上進(jìn)行片段分析。檢測(cè)患者、胎兒及家系中其他相關(guān)個(gè)體共7例（Ⅱ2、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6、Ⅳ6、Ⅳ7、Ⅳ8）片段長(zhǎng)度，判斷重復(fù)次數(shù)在家系中是否具有多態(tài)性以及與疾病的關(guān)聯(lián)情況。

4．G染色體核型分析：羊水細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，之后常規(guī)G顯帶核型分析，判斷胎兒遺性別及染色體是否正常。

5．胎兒超聲檢查：高危胎兒孕24周左右，以西門(mén)子512彩色超聲成像儀進(jìn)行胎兒三維超聲檢查，尤其關(guān)注胎兒內(nèi)外生殖器發(fā)育情況。

結(jié) 果

一、AR基因突變檢測(cè)結(jié)果

2名患者（Ⅲ5、Ⅳ7）AR基因各外顯子及側(cè)翼序列均未見(jiàn)堿基改變。

二、AR基因exon1片段分析結(jié)果

片段分析及測(cè)序結(jié)果提示2名患者（Ⅲ5、Ⅳ7）CAG重復(fù)均為21次（305bp）。Ⅱ2、Ⅲ4、 Ⅲ6、Ⅳ6、Ⅳ8片段長(zhǎng)度為305/317、305/308、305/308、308、305bp?？梢钥闯?1次重復(fù)自Ⅱ2傳遞給Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6，男性個(gè)體Ⅲ5發(fā)病，而女性個(gè)體Ⅲ4、Ⅲ6攜帶，Ⅲ4未將其傳遞給后代Ⅳ6，而Ⅲ6傳給兒子Ⅳ7及胎兒Ⅳ8。所有獲得了21次重復(fù)的男性個(gè)體均有生殖器異常，表明其與疾病連鎖共分離，見(jiàn)圖1。

三、 G染色體核型分析結(jié)果

G顯帶核型分析結(jié)果顯示胎兒為正常男性核型46，XY。

四、 胎兒24周超聲檢查結(jié)果

孕24周+6d，男性胎兒，陰莖偏小，形態(tài)異常，陰莖陰囊部分扭轉(zhuǎn)伴隨尿道下裂，見(jiàn)圖2。

五、妊娠結(jié)局

孕婦知悉以上結(jié)果選擇放棄胎兒，引產(chǎn)胎兒證實(shí)外生殖器確有尿道下裂等畸形。

圖1 PAIS家系圖譜及連鎖分析結(jié)果

圖2 孕24周胎兒生殖器超聲圖像

討 論

PAIS患者的表現(xiàn)輕重不同，臨床診斷上相對(duì)困難。PAIS患者基礎(chǔ)狀態(tài)的T和LH較正常男性明顯增高，因T可以轉(zhuǎn)化為雌激素，故而多數(shù)患者E2水平也同時(shí)增高［15］。根據(jù)臨床表現(xiàn)、典型的激素水平以及X連鎖隱性遺傳家族史，即可診斷為PAIS［15,16］。本研究家系呈現(xiàn)明顯的X連鎖隱性遺傳特性，所有患者生殖器均發(fā)育不良，而且成年患者均有乳腺發(fā)育及不育，一例成年患者性激素T、LH、E2增高情況也符合PAIS特征，因此PAIS的診斷明確。

對(duì)此家系2名患者的AR基因進(jìn)行了較為仔細(xì)的測(cè)序分析，遺憾的是未能找到致病基因突變。而根據(jù)相關(guān)研究，一半以上的PAIS患者不能明確基因異常位置［2］，其原因可能是突變存在于AR基因的非編碼區(qū)、內(nèi)含子或者基因的調(diào)控區(qū)。隨著現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，后續(xù)研究可以對(duì)AR基因進(jìn)行擴(kuò)大范圍檢測(cè)，有望明確患者的基因變異。

PAIS患者社會(huì)性別為男性，癥狀較社會(huì)性別為女性的CAIS輕，但具有男性化不足、女性第二性征和生育功能缺陷等，給患者本人和家屬帶來(lái)更大、更長(zhǎng)期的生理及心理負(fù)擔(dān)，即使手術(shù)可以部分矯正異常，但也無(wú)法恢復(fù)到正常男性的生理功能［17］。當(dāng)一個(gè)家庭出現(xiàn)PAIS患者時(shí)，明確突變類型并進(jìn)行產(chǎn)前診斷是避免患兒出生和降低再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的唯一途徑。

孕中期超聲可以發(fā)現(xiàn)多種胎兒生殖器的異常［18］，但生殖器畸形病因繁多，需進(jìn)行鑒別診斷。有研究者認(rèn)為，對(duì)于單純尿道下裂胎兒來(lái)說(shuō)，首先要考慮的就是部分型雄激素不敏感綜合征（PAIS）存在的可能［19］。此高危胎兒核型分析明確為男性，超聲發(fā)現(xiàn)其陰莖短小、陰莖陰囊部分扭轉(zhuǎn)及尿道下裂，再結(jié)合家系遺傳方式及兩名患者的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，可以確定胎兒罹患PAIS。

因基因突變無(wú)法明確這就給產(chǎn)前診斷帶來(lái)了極大的困難，在這種情況下，對(duì)家系成員進(jìn)行連鎖分析并結(jié)合臨床資料推斷胎兒是否罹病，雖然是退而求其次的辦法，但是對(duì)家系避免再次出現(xiàn)PAIS同樣具有非常重要的意義。AR基因第一外顯子CAG重復(fù)在中國(guó)人群屬于高度多態(tài)的位點(diǎn)，并且就在致病基因內(nèi)部，與疾病高度連鎖，因此可視作AIS較好的連鎖分析標(biāo)記。我們發(fā)現(xiàn)CAG的21次重復(fù)（305bp）在此家系與PAIS表型共分離，高危男性胎兒恰巧獲得了此標(biāo)記，提示遺傳到了與疾病連鎖的AR基因，超聲及引產(chǎn)發(fā)現(xiàn)的生殖器畸形也證實(shí)胎兒的確罹患PAIS，從而證實(shí)連鎖分析的可靠性。國(guó)際上，也有應(yīng)用此CAG重復(fù)鑒定致病AR基因，從而進(jìn)行產(chǎn)前診斷的研究報(bào)告［20］。綜述分析，應(yīng)用AR基因exon1的CAG重復(fù)進(jìn)行連鎖分析，有益并且切實(shí)可行。

本研究對(duì)一個(gè)PAIS家系進(jìn)行產(chǎn)前診斷，雖然沒(méi)有能夠找到AR基因突變，但結(jié)合AR基因內(nèi)部的CAG重復(fù)次數(shù)與疾病的連鎖關(guān)系及產(chǎn)前超聲影像胎兒生殖器畸形情況，明確胎兒罹患部分型雄激素不敏感綜合征，為不能明確突變類型的CAIS及PAIS家系產(chǎn)前診斷提供一個(gè)較好先例，對(duì)AIS的遺傳學(xué)診斷和優(yōu)生咨詢均具有一定的借鑒意義。

1 Mendoza N, Motos MA. Androgen insensitivity syndrome.Gynecol Endocrinol2013；29（1）:1-5

2 Gottlieb B, Beitel LK, Nadarajah A,et al. The Androgen Receptor Gene Mutations Database: 2012 Update.Hum Mutat2012；33（5）: 1317-1327

3 Lek N, Miles H, Bunch T,et al. Low frequency of androgen receptor gene mutations in 46 XY DSD, and fetal growth restriction.Arch Dis Child2014；99（4）:358-361

4 Rajender S, Singh L, Thangaraj K. Phenotypic heterogeneity of mutations in androgen receptor gene.Asian J Androl2007；9（2）:147-179

5 任維果, 周自寅, 邊家盛, 等. 前列腺鱗狀細(xì)胞癌1例報(bào)告并文獻(xiàn)復(fù)習(xí). 中國(guó)男科學(xué)雜志 2008；22（10）: 48-50

6 王鋼, 陳光椿, 王曉慧, 等. 中國(guó)男性雄激素受體基因（CAG）n重復(fù)多態(tài)性的初步研究. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志2001；18（6）: 456-458

7 張釧, 郭孟境, 裴利國(guó), 等. 寧夏回、漢族群體雄激素受體基因（CAG）n、（GGN）n重復(fù)多態(tài)性研究. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志 2013；30（3）: 365-369

8 吳維青, 羅福薇, 耿茜等. 完全型雄激素不敏感綜合征雄激素受體基因突變分析. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志 2009；26（6）: 606-609

9 信艷萍, 吳慶華, 張毅等. 兩個(gè)雄激素不敏感綜合征家系中AR基因突變檢測(cè). 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版 2015；50（2）: 202-206

10 張建平, 王曉春, 金杭美. 睪丸女性化綜合征17例臨床分析. 蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版 2009；29（1）: 176-177,179

11 李莉平, 徐建平. 男性假兩性畸形—不完全性雄激素不敏感綜合征1例. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版2002；23（2）: 121

12 龔飛鳳, 訾聃, 周遵倫, 等. 不完全性雄激素不敏感綜合征1例. 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) 2008；33（5）: 565-566

13 李強(qiáng), 李森愷, 徐家杰等. 尿道下裂患者雄激素受體基因突變的研究. 中華整形外科雜志 2004；20（6）: 421-424

14 李座祥, 唐文豪, 汪朝暉等. 中國(guó)特發(fā)性無(wú)精子癥和少精子癥患者雄激素受體基因CAG重復(fù)多態(tài)性研究. 中華男科學(xué)雜志 2005；11（5）: 335-338

15 Melo KF, Mendonca BB, Billerbeck AE,et al. Clinical, hormonal, behavioral, and genetic characteristics of androgen insensitivity syndrome in a Brazilian cohort: fi ve novel mutations in the androgen receptor gene.J Clin Endocrinol Metab2003；88（7）:3241-3250

16 Gottlieb B, Pinsky L, Beitel LK,et al. Androgen insensitivity.Am J Med Genet1999；89（4）:210-217

17 Rybar R, Markova P, Veznik Z,et al. Sperm chromatin integrity in young men with no experiences of infertility and men from idiopathic infertility couples.Andrologia2009；41（3）: 141-149

18 Pajkrt E, Petersen OB, Chitty LS. Fetal genital anomalies: an aid to diagnosis.Prenat Diagn2008；28（5）:389-398

19 Chitty LS, Chatelain P, Wolffenbuttel KP,et al.Prenatal management of disorders of sex development.J Pediatr Urol2012；8（6）:576-584

20 Fogu G, Bertini V, Dessole S,et al. Identification of a mutant allele of the androgen receptor gene in a family with androgen insensitivity syndrome: detection of carriers and prenatal diagnosis.Arch Gynecol Obstet2004；269（4）:266-269

（2016-05-08收稿）

Genetic analysis and prenatal diagnosis in a family with partial androgen insensitivity syndrome＊

Wu Weiqing1, Wen Huaxuan2, Yuan Hui3, Xie Jiansheng1**
1. Central Laboratory, Southern Medical University Affiliated Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital, Shenzhen 518028, Guangdong, China；2. Department of Ultrasonography, Southern Medical University Affiliated Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital, Shenzhen；3. Department of Obstetrics, Southern Medical University Affiliated Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital

Xie Jiansheng, Email:jianshengxie2000@aliyun.com

Objective To detect AR gene mutation in 2 patients of a partial androgen insensitivity syndrome family and perform prenatal diagnosis for the high risk fetus.MethodsEight exons and at least 100bp fl anking intrinsic sequence of AR gene were screened by PCR and direct sequencing. CAG repeats in exon1 of AR gene was used as a STR marker in linkage analysis. The amniocentesis was performed for determination of genetic gender and linkage analysis. The Fetal genital anomalies were scanned by color Doppler ultrasound.ResultsNo mutation was found in two patients' AR gene. Linkage analysis indicated that the 21 times of CAG repeats was related to the phenotype in this family. The male fetus inherited the 21 times repeat of CAG, and antenatal sonographic diagnosis showed its external genitals was abnormal（micropenis, perineoscrotal hypospadia）.ConclusionMale fetus was still diagnosed as PAIS based on the results of linkage analysis and sonographic diagnosis, although no specific mutations of AR gene were detected in PAIS patients.

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.06.001

R714.55

資助：本課題受深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（JCYJ201504020904413001）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471204）

**通訊作者，E-mail:jianshengxie2000@aliyun.com