依達(dá)拉奉預(yù)處理對(duì)大鼠腦干缺血再灌注損傷后MDA、SOD的影響

李嬌紅，程錦楠，李小剛

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：1神經(jīng)內(nèi)科；2皮膚科，四川瀘州 646000）

依達(dá)拉奉預(yù)處理對(duì)大鼠腦干缺血再灌注損傷后MDA、SOD的影響

李嬌紅1，程錦楠2，李小剛1

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：1神經(jīng)內(nèi)科；2皮膚科，四川瀘州 646000）

目的：用依達(dá)拉奉(EDA)對(duì)大鼠預(yù)處理，觀察其對(duì)大鼠腦干缺血再灌注損傷后丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)水平的影響，探討研究EDA對(duì)腦干缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：將25只SD大鼠隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組5只、缺血再灌注組和依達(dá)拉奉預(yù)處理組各10只。根據(jù)缺血時(shí)間的不同，把缺血再灌注組和依達(dá)拉奉預(yù)處理組分為缺血1 h再灌注7 h和缺血3 h再灌注5 h兩個(gè)亞組，每亞組5只大鼠。其中對(duì)照組：暴露基底動(dòng)脈（BA）第一無(wú)分支區(qū)和第二無(wú)分支區(qū)，觀察8 h；缺血再灌注組：用微型動(dòng)脈夾夾閉基底動(dòng)脈第一無(wú)分支區(qū)和第二無(wú)分支區(qū)，分別使之缺血1 h和3 h，再分別灌注7 h和5 h；依達(dá)拉奉預(yù)處理組：各亞組實(shí)驗(yàn)前10 min于大鼠尾靜脈注射依達(dá)拉奉6 mg/kg，其它同缺血再灌注組。HE染色觀察各組腦干組織的病理改變。測(cè)定各組大鼠腦干中MDA及SOD表達(dá)水平。結(jié)果：在缺血1 h時(shí)，與假手術(shù)組和預(yù)處理組比較，缺血再灌注組MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在缺血3h時(shí)，與假手術(shù)組比較，預(yù)處理組和缺血再灌注組MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與預(yù)處理組比較，缺血再灌注組MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：依達(dá)拉奉預(yù)處理通過(guò)減少M(fèi)DA含量、增加SOD活性，清除自由基、對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化等機(jī)制，對(duì)大鼠腦干缺血再灌注具有一定的保護(hù)作用。

依達(dá)拉奉；預(yù)處理；腦干缺血再灌注損傷；MDA；SOD

世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)告顯示，腦血管疾病已成為全球成年人第一位致死性疾病和第二位致殘性疾病。因此對(duì)腦卒中的預(yù)防顯得尤為重要。腦干缺血再灌注損傷是指腦干組織缺血缺氧一段時(shí)間后，當(dāng)血管再通或血流重新恢復(fù)時(shí)，腦干組織的損傷程度反而較缺血時(shí)進(jìn)一步加重，其癥狀進(jìn)一步惡化的表現(xiàn)。缺血再灌注損傷是近年來(lái)醫(yī)學(xué)研究中的熱門領(lǐng)域，已被臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。藥物預(yù)處理是缺血預(yù)處理的發(fā)展趨勢(shì)，其既不損傷器官又能產(chǎn)生預(yù)處理效果，所以藥物預(yù)處理是神經(jīng)保護(hù)的新前途，為缺血再灌注腦損傷的預(yù)防提供了一新思路，具有很大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。相關(guān)臨床試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)研究均表明：依達(dá)拉奉（EDA）作為自由基清除劑，對(duì)組織缺血再灌注損傷具有強(qiáng)有效的保護(hù)作用。其可清除顱內(nèi)羥基基團(tuán)，減輕細(xì)胞毒性，且可降低急性腦梗死后腦組織炎性標(biāo)記物的表達(dá)，減少繼發(fā)性腦缺血后損傷[1]。雖然關(guān)于EDA治療腦干梗死的臨床療效觀察已證實(shí)其對(duì)腦干梗死有保護(hù)作用，但關(guān)于其在腦干缺血再灌注損傷過(guò)程中的保護(hù)作用機(jī)制的基礎(chǔ)性研究，國(guó)內(nèi)的相關(guān)報(bào)道仍罕見。因此本文通過(guò)比較大鼠腦干缺血再灌注組織中丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）的含量與EDA預(yù)處理后腦干組織中指標(biāo)表達(dá)的變化，進(jìn)一步研討和明確依達(dá)拉奉預(yù)處理對(duì)腦干缺血再灌注損傷的影響。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠

準(zhǔn)備成年雄性SD大鼠25只，平均體重約300 g。于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心采購(gòu)。動(dòng)物飼養(yǎng)5～7 d使大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

1.2 主要試劑和儀器

硫酸阿托品；2%戊巴比妥鈉；尼克剎米注射液；梯度乙醇；明礬蘇木精；1%伊紅水溶液；MDA、SOD試劑盒（南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供）；依達(dá)拉奉注射液（南京先聲東元制藥有限公司）。實(shí)驗(yàn)用手術(shù)器械；手術(shù)顯微鏡；微型動(dòng)脈夾；自制氣管插管用聚乙烯管；低溫離心機(jī)（德國(guó)D-63405 Hanau）；玻璃勻漿器；電子天平ES-J（沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司）；隔水式電熱恒溫水箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械）；照相顯微鏡等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

25只雄性大鼠隨機(jī)分組，其中假手術(shù)組5只，缺血再灌注組和依達(dá)拉奉預(yù)處理組各10只，各亞組5只。缺血再灌注組根據(jù)缺血時(shí)間不同分為缺血1 h灌注7 h（I1R7）和缺血3 h灌注5 h（I3R5）兩個(gè)亞組。依達(dá)拉奉預(yù)處理組分組同缺血再灌注組，在每亞組實(shí)驗(yàn)前10 min在大鼠尾靜脈處推入依達(dá)拉奉6 mg/ kg預(yù)處理。假手術(shù)組：只分離暴露出基底動(dòng)脈，不予其它處理，可在實(shí)驗(yàn)中用白熾燈距大鼠30 cm處照射，使其保持體溫。每組實(shí)驗(yàn)觀察至8 h，終止模型后測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組腦干組織中MDA、SOD含量。

1.3.2 大鼠腦干缺血再灌注模型建立

大鼠行2%戊巴比妥鈉麻醉后取仰臥位，于手術(shù)臺(tái)上固定頭部及四肢。皮下注射硫酸阿托品使氣管分泌物減少。去毛、消毒后暴露氣管，氣管切開后氣管插管，剪除枕骨基底所附著的肌肉及剪斷兩側(cè)枕骨骸處，剪開枕骨基底面，除骨組織，形成骨窗。剪除硬腦膜，去除蛛網(wǎng)膜，小心暴露基底動(dòng)脈（BA），可清晰顯示基底動(dòng)脈分支（腦橋支、小腦下前動(dòng)脈、小腦上動(dòng)脈及椎動(dòng)脈），其無(wú)分支區(qū)分別位于起始處和前、中段移行處即小腦下前動(dòng)脈前方。缺血再灌注組在BA兩個(gè)無(wú)分支處分別用微型動(dòng)脈夾夾閉，維持1 h、3 h，期間予生理鹽水沖泡的紗布覆蓋傷口，之后分別對(duì)應(yīng)7 h、5 h后移除動(dòng)脈夾，使BA再通形成再灌注。依達(dá)拉奉預(yù)處理組在夾閉動(dòng)脈前10 min于大鼠尾靜脈注射依達(dá)拉奉6 mg/kg，其余同缺血再灌注組。

1.3.3 術(shù)后HE染色、光鏡觀察及MDA、SOD的測(cè)定

各實(shí)驗(yàn)組終止觀察后快速斷頭取腦，去除大腦、小腦，將所得的腦干組織塊漂洗、吸干、切片、保存?zhèn)溆?。切片脫蠟、染色、分色、沖洗、復(fù)染、脫水、封片等制備HE染色切片行常規(guī)病理觀察。檢測(cè)前取出腦干組織塊，制成10%的組織勻漿，取上清液儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用TBA比色法進(jìn)行測(cè)定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性；嚴(yán)格按照MDA、SOD試劑盒使用說(shuō)明來(lái)操作，然后計(jì)算結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心協(xié)作完成。

1.4 結(jié)果判定

動(dòng)物模型制作過(guò)程中，通過(guò)觀察大鼠生命體征及神經(jīng)癥狀（呼吸節(jié)律、瞳孔大小、對(duì)光反射靈敏度、眼球震顫及肢體活動(dòng)等），判斷模型是否制備成功（34只大鼠參與造模，成功率73.5%）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色、光鏡觀察（×200）

假手術(shù)組：神經(jīng)細(xì)胞、血管等組織結(jié)構(gòu)未見明顯水腫、出血及壞死。缺血再灌注組：I1R7組可見細(xì)胞水腫為主；I3R5組細(xì)胞水腫明顯，可見血管充血。依達(dá)拉奉預(yù)處理組：I1R7、I3R5可見細(xì)胞水腫，預(yù)處理后病理改變較相應(yīng)缺血再灌注組減輕（圖1～6）。

圖1 正常神經(jīng)細(xì)胞（HE×200）

圖2 正常神經(jīng)細(xì)胞（HE×200）

圖3 缺血再灌注組水腫（I1R7：HE×200）

圖4 缺血再灌注組充血（I3R5：HE×200）

圖5 預(yù)處理組水腫（I1R7：HE×200）

圖6 預(yù)處理組水腫（I3R5：HE×200）

2.2 大鼠腦干組織MDA含量變化

表1 腦干組織MDA含量測(cè)定（nmol/mL）（）

表1 腦干組織MDA含量測(cè)定（nmol/mL）（）

注：a與再灌注組比較，P＜0.05；b與假手術(shù)組比較，P＜0.05

分組假手術(shù)組再灌注組預(yù)處理組F P 1 h 6.19±0.70a11.44±1.26 7.25±1.09a36.830 0.001 3 h 6.44±0.70a14.18±0.75 7.84±0.92ab133.818 0.000

從表1可見：在缺血1 h時(shí)，缺血再灌注組MDA含量高于假手術(shù)組和預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在缺血3h時(shí)，與假手術(shù)組比較，預(yù)處理組和缺血再灌注組MDA含量明顯升高，且缺血再灌注組高于預(yù)處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 大鼠腦干組織SOD含量變化

表2 腦干組織SOD活性的測(cè)定（U/mL）（）

表2 腦干組織SOD活性的測(cè)定（U/mL）（）

注：a與再灌注組比較，P＜0.05；b與假手術(shù)組比較，P＜0.05

分組假手術(shù)組再灌注組預(yù)處理組F P 1 h 101.83±6.30a89.13±7.03 97.66±4.13a5.917 0.016 3 h 100.39±5.93a85.65±4.91 93.03±4.48ab10.266 0.003

由表2可見：在缺血1 h時(shí)，缺血再灌注組SOD含量低于假手術(shù)組和預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在缺血3 h時(shí)，與假手術(shù)組比較，預(yù)處理組和缺血再灌注組SOD含量明顯降低，且缺血再灌注組低于預(yù)處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。

3 討論

腦干缺血再灌注的動(dòng)物模型制作較困難，其原因包括多方面：腦干血供復(fù)雜、側(cè)枝循環(huán)建立豐富、明確單一缺血區(qū)困難、與人體腦干結(jié)構(gòu)相似的動(dòng)物模型少、腦干損傷死亡率高。故本實(shí)驗(yàn)大鼠每亞組采用5只。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合Hukuba N等[2]、Alkan T等[3]、Fang Cao等[4]的相關(guān)方法完成動(dòng)物模型的建立，用夾閉法阻斷基底動(dòng)脈第一、第二無(wú)分支區(qū)，相比其它方法其優(yōu)點(diǎn)是使腦干具體缺血部位穩(wěn)定，延髓的血供得到保障，降低了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率。研究表明，腦梗死的最佳治療時(shí)間窗為急性腦梗死發(fā)病后3～6 h以內(nèi)[5]。而腦梗死治療時(shí)間窗經(jīng)相關(guān)研究報(bào)道：發(fā)病后24 h內(nèi)是超早期治療的最佳時(shí)期[6]。經(jīng)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦缺血后再灌注時(shí)間窗較人類短，約為人類的1/3～1/2，大約為3 h[7]。因此本實(shí)驗(yàn)缺血時(shí)間定在3 h以內(nèi)，以保證依達(dá)拉奉預(yù)處理在再灌注損傷的最佳時(shí)間段即時(shí)間窗范圍左右。

依達(dá)拉奉作為特異性自由基清除劑，可有效清除氧自由基、腦中高度細(xì)胞毒性的羥基基團(tuán)、黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤氧化酶等。它是一種捕獲羥自由基（-OH）的活性抗氧劑，可降低羥自由基濃度。依達(dá)拉奉具脂溶性特點(diǎn)，比較順利的通過(guò)血腦屏障，進(jìn)入腦脊液。血漿和腦脊液中藥物濃度比率可達(dá)到68%，且靜脈給藥后可迅速到達(dá)腦內(nèi)或脊髓中。且其具有改善神經(jīng)細(xì)胞，抑制腦水腫形成,而不影響血小板的功能[8]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道：予以依達(dá)拉奉10 mg/kg經(jīng)尾靜脈注射效果優(yōu)于6 mg/kg靜注[9]，故本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)前10 min，予以依達(dá)拉奉10 mg/kg劑量預(yù)處理。目前依達(dá)拉奉已廣泛應(yīng)用于腦缺血再灌注損傷中，大量的基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)已證實(shí)其可緩解腦水腫、抑制遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡，機(jī)制可能為清除自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化，從而達(dá)到改善神經(jīng)缺損癥狀及臨床表現(xiàn)的作用?？傊肋_(dá)拉奉通過(guò)清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷及抑制遲發(fā)性神經(jīng)元死亡等機(jī)制，阻止腦水腫和腦損傷的進(jìn)展。因此，依達(dá)拉奉作為預(yù)處理藥物，是比較適合于臨床缺血性腦血管疾病的預(yù)防和改善預(yù)后的，在確保安全的前提下，對(duì)缺血性腦血管疾病的高危人群亦有一定的實(shí)用價(jià)值。目前，雖然研究已證實(shí)，依達(dá)拉奉預(yù)處理可減少大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織的損傷，對(duì)腦組織有保護(hù)作用，且依達(dá)拉奉預(yù)處理可減輕心肌、骨骼肌、肝臟、腸等器官組織的缺血再灌注損傷[10-11]，但其對(duì)腦干缺血再灌注損傷影響的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)性研究仍較缺乏。故本實(shí)驗(yàn)主要研究探討依達(dá)拉奉預(yù)處理對(duì)大鼠腦干缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制的影響。

在腦干缺血再灌注損傷機(jī)制中，大量自由基的產(chǎn)生是其主要因素之一。腦干組織中局部缺血、缺氧，血管阻塞、破裂，紅細(xì)胞變性、壞死等都可刺激生成自由基，自由基的產(chǎn)生可誘導(dǎo)三大物質(zhì)（脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸）過(guò)氧化，細(xì)胞膜受損。氧自由基，特別是超氧自由基是組織器官局灶性缺血再灌注后細(xì)胞水腫和凋亡的主要病因。而神經(jīng)細(xì)胞更易受到氧自由基的攻擊，因其細(xì)胞膜富含膽固醇及多價(jià)不飽和脂肪酸。氧自由基與生物細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，其代謝產(chǎn)物即為丙二醛（MDA），因此測(cè)定組織中MDA的含量即可間接反映組織中自由基的含量及脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。故腦干組織MDA含量越高，氧自由基水平也越高，組織損害越嚴(yán)重。超氧化物歧化酶（SOD）是一種帶負(fù)電荷的金屬蛋白酶，能在生物體內(nèi)通過(guò)歧化的方式清除氧自由基，減少自由基與其他物質(zhì)的氧化，從而保護(hù)生物體免遭自由基的攻擊[12]，因此檢測(cè)SOD表達(dá)水平的高低可間接反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力，腦干組織SOD活力越高，自由基水平越低，而組織損傷越輕，即腦干組織SOD活力高低與組織損傷程度成反比。本實(shí)驗(yàn)中，腦干組織MDA含量缺血再灌注組較假手術(shù)組顯著升高，且隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，MDA含量逐漸增高，即腦干再灌注損傷越嚴(yán)重。依達(dá)拉奉預(yù)處理組MDA含量也較假手術(shù)組高，與缺血再灌注組相比均下降，以缺血1 h再灌注7 h明顯，即依達(dá)拉奉預(yù)處理后，灌注損傷程度減輕。而腦干組織SOD活性，缺血再灌注組較假手術(shù)組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)降低；依達(dá)拉奉預(yù)處理組中依達(dá)拉奉預(yù)處理后較缺血再灌注組的SOD活性升高明顯。從中說(shuō)明，依達(dá)拉奉預(yù)處理后，缺血3 h內(nèi)再灌注損傷都有一定程度的緩解，其中缺血時(shí)間越短緩解越明顯。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦干缺血再灌注依達(dá)拉奉預(yù)處理可增加SOD活性、減少M(fèi)DA含量，對(duì)大鼠腦干缺血再灌注損傷有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除自由基，對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化等有關(guān)。

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（2016-01-20收稿）

Effect of Edaravone pretreatment on MDA and SOD of brainstem after ischemical reperfusion injury in rats

Li Jiaohong1，Cheng Jinglan2，Li Xiaogang11Department of Neurology；2Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan Province，China

Objective：To evaluate the protective effect of Edaravone on brainstem after ischemia/reperfusion injury and to provide experimental evidence for clinic,rats were pretreated with Edaravone and its effect on MDA and SOD were studied.Methods：25 SD rats used in experimental animals were divided into 3 groups at random: sham operation group，brainstem ischemia reperfusion group and Edaravone pretreatment group（n=10）.According to different ischemia time period,rats in ischemia/reperfusion group and Edaravone pretreatment group were further divided evenly into ischemia 1 h/reperfusion 7 h and ischemia 3 h/reperfusion 5 h subgroups,respectively. The 1st and the 2nd basilar artery without branch areas were exposed,and animals were observed without any treatment for 8 h in normal group,the arteries were clamped with Micro-bulldog clamp to create ischemia for 1 h/ reperfusion 7 h（5 animals）and ischemia for and 3 h/reperfusion 7 h （5 animals）respectively in ischemia reperfusion group,and animals in Edaravone pretreatment group were given Edaravone（6 mg/kg）by tail vein injection 10 min before ischemia/reperfusion as described in ischemia/reperfusion group.The histology of brainstems after HE staining were compared,the brainstem tissues at various stages was observed by light microscope at 200 magnification.The activities of SOD and the contents of MDA at various subgroups were measuredwith spectrophotometry.Results:When the time on ischemia 1 h,compared with the normal group and pretreatment group,the contents of MDA were significantly increased and the contents of SOD were obviously decreased in ischemia reperfusion group,the differences all had statistical significance（P＜0.05）.When the time on ischemia 3 h,compared with the normal group,the contents of MDA were significantly increased and the contents of SOD were obviously decreased in pretreatment group and ischemia reperfusion group,the differences all had statistical significance（P＜0.05）;Compared with the pretreatment group,the contents of MDA were significantly increased and the contents of SOD were obviously decreased in ischemia reperfusion group,the differences all had statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：Edaravone played a tremendous and definite role in ischemia reperfusion injury of brainstem in rats.Its mechanism has to do with the reduced levels of MDA,the increased activity of SOD,the removal of oxyradicals,and the inhibited overoxidation of lipid.

Edaravone；Pretreatment；Brainstem ischemical reperfusion；MDA；SOD

R743

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.005

李嬌紅（1986-），女，碩士，醫(yī)師。E-mail:61752273@qq.com