氧化應激對靜脈性潰瘍SDF-1α/CXCR4時相性表達的影響

鐘 武，楊 帆

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急診醫(yī)學部，四川瀘州 646000）

氧化應激對靜脈性潰瘍SDF-1α/CXCR4時相性表達的影響

鐘 武，楊 帆

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急診醫(yī)學部，四川瀘州 646000）

目的：探討靜脈性潰瘍組織中氧化應激反應對SDF-1α/CXCR4表達時相的影響。方法：56例靜脈性潰瘍患者的潰瘍創(chuàng)面標本，其中男性40例，女性16例，按病程分為：2周組；3周組；4周組；5周組，以正常皮膚56例作為對照組,測定氧化應激產物丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）。Western blot檢測各組潰瘍創(chuàng)面SDF-1α、CXCR4表達趨勢，結果用灰度值分析；用免疫熒光雙染色檢測SDF-1α/CD31在潰瘍組織中表達的相關性。結果：發(fā)病3周后，靜脈性潰瘍組織MDA含量較正常皮膚組明顯升高（P＜0.05），GSH含量則明顯降低（P＜0.05）。Western blot結果顯示靜脈性潰瘍SDF-1α、CXCR4變化趨勢一致，與正常皮膚組比較，病程＞3周各組表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），氧化應激產物變化與SDF-1α、CXCR4表達聯(lián)系密切。經免疫熒光雙染色顯示，發(fā)病3周后，靜脈性潰瘍組織中SDF-1α、CD31的表達下調。結論：靜脈性潰瘍創(chuàng)面氧化應激反應持續(xù)增強，引起SDF-1α/CXCR4表達下調，可能與靜脈性潰瘍修復障礙有關。

基質細胞衍生因子-1α；趨化因子受體4；靜脈性潰瘍；氧化應激

靜脈性潰瘍繼發(fā)于下肢靜脈功能不全[1]（chronic venous insufficiency，CVI），治療效果較差[2]。目前，靜脈性潰瘍發(fā)病機制尚未完全闡明，但已有研究表明氧化應激是靜脈性潰瘍繼發(fā)血管新生障礙中的重要環(huán)節(jié)[3]，而基質細胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）及CXC趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）組成的生物軸能在缺血缺氧組織中高表達[4]，并且氧化應激產物能促進SDF-1α/CXCR4趨化陽性表達的骨髓間充質干細胞向損傷部位募集[5]，使其在多種組織的再生過程中發(fā)揮著重要調控作用。但是靜脈性潰瘍組織中氧化應激與SDF-1α/CXCR4表達變化的內在聯(lián)系尚不清楚，本研究通過觀察氧化應激狀態(tài)下SDF-1α/CXCR4表達的時相性變化，探討氧化應激對靜脈性潰瘍修復的影響機制。

1 資料和方法

1.1 一般資料與分組

采集我院2014年1月至2015年1月收治的56例靜脈性潰瘍患者下肢潰瘍創(chuàng)面標本，其中男性40例，女性16例，平均年齡（55.37±4.22）歲，按潰瘍病程分為：2周組；3周組；4周組；5周組。每組14人。取材要求：切除與正常皮膚交界處潰瘍組織，約0.3 cm×0.3 cm大小，以檢測氧化應激對潰瘍修復的影響。取下肢淺表良性腫瘤梭形切除時的正常皮膚56例作為對照組，平均年齡（56.48±4.37）歲，取材前排除血管性疾病、糖尿病等。

1.2 實驗試劑及儀器

谷胱甘肽（GSH）試劑盒，丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成公司），小鼠SDF-1α單克隆抗體（abcom，英國），小鼠多克隆二抗（abcom，英國），兔CXCR4多隆抗體（abcom，英國），兔多克隆二抗（abcom，英國），小鼠CD31多克隆抗體（GenTex，美國），小鼠多克隆二抗（GenTex，美國），小鼠GAPDH單克隆抗體（abcom，英國），BZI-9000熒光顯微鏡 （日本），LAS400顯像系統(tǒng)（日本）。

1.3 MDA、GSH檢測

取正常皮膚、靜脈性潰瘍新鮮組織后，碾磨成組織勻漿，用MDA檢測試劑盒，硫代巴比妥酸法測定標本中的MDA含量；比色法定量測定GSH含量。

1.4 Western blot檢測

RIPA提取組織蛋白，凝膠電泳后轉膜，脫脂牛奶封閉 2 h分別滴加一抗SDF-1α（1∶1 000）、CXCR4（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育過夜。次日，洗膜后滴加相應小鼠多克隆二抗（1∶2 000），兔多克隆二抗（1∶2 000）。室溫孵育1 h用LAS400顯像系統(tǒng)觀察顯影，成像后采用IMAGE J2X軟件測定條帶灰度值行半定量分析。

1.5 免疫熒光雙染色

每個標本連續(xù)切5 μm厚切片，經固定、通透后山羊血清室溫封閉30 min，分別滴加兔CXCR4多隆抗體（1∶100）、小鼠CD31多克隆抗體（1∶100），避光孵育 1 h后，加入對應兔多克隆二抗（1∶200），小鼠多克隆二抗（1∶200）；熒光顯微鏡下觀察、采集圖像。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 不同類型潰瘍MDA、GSH的濃度檢測。

在532 nm和 420 nm分別測定正常皮膚組和潰瘍組MDA、GSH的吸光度，經公式計算正常皮膚組MDA的含量為（0.41±0.33）nmol∕mL，GSH的含量為（8.52±1.91）nmol∕mL；MDA、GSH濃度在靜脈性潰瘍病程三周開始明顯高于正常皮膚組，且時間越長，升高越明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05，見表1）。

表1 各組潰瘍MDA、GSH含量比較（nmol∕mL,）

表1 各組潰瘍MDA、GSH含量比較（nmol∕mL,）

注：a表示與皮膚對照組、靜脈性潰瘍2 W組比較，P＜0.05；b表示與靜脈性潰瘍3 W組比較，P＜0.05；c表示與靜脈性潰瘍4 W組比較，P＜0.05

組別正常皮膚組靜脈性潰瘍2 W組靜脈性潰瘍3 W組靜脈性潰瘍4 W組靜脈性潰瘍5 W組n 56 14 14 14 14 F P MDA（nmol∕mL）0.41±0.33 0.56±0.54 2.55±0.41a5.69±0.41ab8.86±0.46abc5.391＜0.05 GSH（mg∕L）8.52±1.91 7.94±1.17 5.60±1.02a2.88±0.71ab1.13±0.62abc6.332＜0.05

2.2 SDF-1α/CXCR4在潰瘍組織中的表達

通過Western blot檢測，靜脈性潰瘍組中發(fā)病3周后SDF-1α、CXCR4表達明顯升高，但4周后，隨著MDA濃度持續(xù)升高，SDF-1α、CXCR4含量逐漸下降，直至 5周時已降至正常水平，灰度值分析顯示，靜脈性潰瘍病程2周、3周組與正常皮膚比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1A、1B。病程 4周、5周組與病程2周、3周組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1A、1C。

圖1 各組靜脈性潰瘍SDF-1α、CXCR4表達的時相性變化

2.3 SDF-1α、CD31免疫熒光雙染色

SDF-1α、CD31雙染色，結果示：靜脈性潰瘍早期（2～3周），SDF-1α、CD31表達上調，病程4周、5周組SDF-1α、CD31表達顯著降低，在某些區(qū)域出現(xiàn)點狀融合，共同表達于潰瘍組織中（圖2）。

圖2 免疫熒光雙染色檢測靜脈性潰瘍各個病程組SDF-1α/CD31表達相關性（×400）

3 討論

氧化應激在調控細胞凋亡、增殖、衰老和分化過程中起著關鍵作用[6]。脂質過氧化產物—丙二醛可反映潰瘍組織過氧化程度[7]，GSH參與清除ROS防護氧化應激對機體產生的損傷[8]。其含量可在一定程度上反映機體的抗氧化能力[8-9]。目前人類已知的趨化因子達40多種，SDF-1α屬于CXC類，它可以激活其特異性受體CXCR4，在缺血、缺氧的環(huán)境下表達增強[10]，促進血管新生[11]，CXCR4會誘導間充質干細胞在SDF-1α/CXCR4生物軸的調控下向損傷部位遷移，提高損傷修復功能[12]。SDF-1α/CXCR4通路還參與骨髓中性粒細胞動員[13]，與組織損傷后中性粒細胞向損傷部位的遷移密切相關[14]。目前已證實，SDF-1α/CXCR4生物軸這種募集細胞促進損傷修復的過程在骨、肌肉等多種組織器官損傷修復中有極大的調控潛力[15]。

對于靜脈性潰瘍，其再生修復過程需要穩(wěn)定的內環(huán)境，充足的血供和前體細胞以及多種活性因子協(xié)同參與[16]，在潰瘍組織中，氧化應激一方面可直接介導組織損傷，另一方面活性氧自由基可抑制組織促修復因子（SDF-1、FGF、EGF、TGF-β等）向損傷部位遷移[17]，臨床上表現(xiàn)為創(chuàng)面遷延不愈。本研究針對氧化應激與SDF-1α/CXCR4的內在聯(lián)系，結果發(fā)現(xiàn)在靜脈性潰瘍創(chuàng)面SDF-1α、CXCR4與MDA、GSH出現(xiàn)明顯變化是從病程3周開始，隨著MDA濃度持續(xù)升高，GSH含量不足以抑制局部氧化作用，3周后潰瘍SDF-1α、CXCR4表達隨即受到明顯抑制，病程5周時已降至正常水平，CXCR4變化趨勢與SDF-1α一致，氧化應激導致局部SDF-1α/CXCR4的量相對不足。同樣，病程3周后CD31、CXCR4表達下降，與Western blot檢測SDF-1α、CXCR4的時相變化一致，結合分析MDA、GSH變化趨勢表明氧化應激明顯抑制潰瘍局部血管新生。以上結果說明，病程前3周可能是靜脈性潰瘍病情演變的時間窗。

研究表明：靜脈性潰瘍創(chuàng)面氧化應激反應持續(xù)增強，抗氧化能力減弱，抑制SDF-1α/CXCR4生物軸對損傷組織的修復功能，阻礙血管新生，加重局部缺血缺氧程度，如果爭取在SDF-1α/CXCR4變化時間窗內（發(fā)病3周內）進行抗氧化應激相關治療，有望成為此類疾病新的治療方向。

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（2016-01-20收稿）

Effect of oxidative stress on the expression of SDF-1琢/CXCR4 in venous ulcer

Zhong Wu，Yang Fan
Department of Emergency Medicine，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000,Sichuan Province,China

Objective：To investigate the effect of oxidative stress on the expression of SDF-1α/CXCR4 in venous ulcer.Methods：Ulcer samples were obtained from 56 patients including 40 males and 16 females with lower extremity venous ulcer treated.The ulcer samples were divided into 2,3,4,and 5 weeks groups based on the duration of the disease,and normal skin samples from 56 patients were used as controls.The oxidative stress products,MDA and GSH were analyzed.The expression of SDF-1α and CXCR4 was analyzed by western blot followed by densitometry analysis,and the colocalization ofSDF-1α and CD31 wasevaluated by immunofluorescence double staining.Results:After 3 weeks the concentration of MDA increased,whereas that of GSH decreased significantly（P＜0.05）respe-ctively compared to controls.The expression of both SDF-1α and CXCR4 was gradually decreased,which became significant（P＜0.05）after 3 weeks compared with that in the control groups.Immunofluorescence double staining revealed that the level of SDF-1α and CD31 was also markedly decreased in the venous ulcer group after 3 weeks compared with those in the control group,SDF-1α and CD31 colocalization was observed.Conclusion：The decreased expression of SDF-1α/CXCR4 induced by oxidative stress is possibly associated with the pathogenesis of venous ulcer.

Stromal cell derived factor-1α；Chemokine recceptor 4；Venous ulcer；Oxidative stress

R654.4

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.004

鐘 武（1973-），男，主任醫(yī)師，教授。E-mail：zhongwu2876@sina.com