羅漢果柱頭可授性及花粉活力測定研究

郭麗霞　藍(lán)福生　張燕玲　潘利清

摘要：【目的】找出羅漢果柱頭可授性的變化規(guī)律，延長羅漢果授粉時間和增加授粉機(jī)會，提高羅漢果授粉成功率?！痉椒ā坎捎萌旧ā⒚劝l(fā)法測定花粉活力及柱頭可授性?！窘Y(jié)論】羅漢果人工噴霧授粉前，確定花粉活力及柱頭可授性，可提高噴霧授粉成功幾率；花粉離體萌發(fā)法、MTT（噻唑藍(lán)）染色法分別為羅漢果花粉活力及柱頭活力測定的最適合方法。

關(guān)鍵詞：羅漢果；柱頭可授性；花粉活力

中圖分類號：S668.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1003-4374（2015）06-012-04

Abstract：Pollen viability and stigma receptivity were identified before artificial pollination using pollen suspension spray of momordica grosvenor. We applied staining technique and germination in vitro for vitality test.The study found that the pollen grain viability was measured by germination rates using liquid medium. And the best method of stigma receptivity was measured by dyeing rate by MTT.

Keyword：momordica Grosvenor；stigma receptivity；Pollen viability

羅漢果為雌雄異花授粉植物，需人工授粉才能獲得產(chǎn)量。在人工噴霧授粉之前，花粉質(zhì)量的好壞，不僅影響噴霧授粉的成功，也影響果實(shí)的品質(zhì)，所以有必要研究確定羅漢果花粉活力范圍及其保存技術(shù)。田間授粉成功率的高低，與花粉活力、柱頭狀態(tài)、營養(yǎng)狀態(tài)等植株自身?xiàng)l件有關(guān)，還與田間天氣條件（濕潤、干燥、大風(fēng)、高溫等）條件有關(guān)。為找出羅漢果柱頭可授性的變化規(guī)律，延長羅漢果授粉時間和增加授粉機(jī)會，提高羅漢果授粉成功率，進(jìn)行本試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 品種來源

羅漢果品種來源為桂林市大地生物技術(shù)有限公司提供的“大地二號”植株。

1.2 試驗(yàn)時間和地點(diǎn)

試驗(yàn)地為桂林吉福思羅漢果有限公司實(shí)驗(yàn)室及種植基地，試驗(yàn)時間為2012年至-2014年6-8月羅漢果開花期。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柱頭可授性測定

（1）聯(lián)苯胺過氧化氫法。將聯(lián)苯胺、過氧化氫、水按體積比制成混合液，1%聯(lián)苯胺：3%過氧化氫：水=4：11：22（體積比）配好[1]。將采集的柱頭浸沒在聯(lián)苯胺過氧化氫液內(nèi)。若柱頭具有可授性（呈現(xiàn)出過氧化物酶活性），則降解過氧化氫，柱頭表面變成藍(lán)黑色并有大量氣泡產(chǎn)生，根據(jù)氣泡數(shù)的多少確定其柱頭可授性的強(qiáng)弱。

（2）MTT（噻唑藍(lán)）染色法。稱取0.1g MTT，溶解于5ml配制好的50g/L蔗糖溶液中，搖勻置于冰箱中避光保存。配制好的溶液呈鮮黃色。將柱頭浸沒在MTT溶液中，2-15min后觀察柱頭的顏色變化[2]。若柱頭呈深紫黑色甚至黑色，表示柱頭有活力，具有可授性；若柱頭淺藍(lán)色或柱頭變色不明顯，則柱頭活力差，不具有可授性。

1.3.2 花粉活力測定 采摘當(dāng)天清晨開放的新鮮雄花1朵。用以下三種方法分別測定同一朵雄花花粉的活力。

（1）醋酸洋紅染色法。預(yù)先配制好醋酸洋紅染色液，在凹玻片上滴一滴醋酸洋紅染色液，將花粉輕輕刮入染色液，攪勻，在顯微鏡下觀察花粉粒顏色變化。

（2）TTC染色法。預(yù)先配制好TTC染色液。取少量花粉置于凹玻片上，滴入TTC溶液，用鑷子攪拌均勻，在25-28℃的溫度下放置15-20min后在顯微鏡下觀察。

（3）離體萌發(fā)法。按15%蔗糖+ 0.2g/L硼酸+ 0.05g/L硝酸鈣 + 0.2g/L CMC配制培養(yǎng)液，攪拌溶解后倒入試劑瓶內(nèi)備用。

將配制好的培養(yǎng)液滴一滴在凹玻片凹槽內(nèi)，用鑷子挑取適量花粉混勻，置于有濕潤濾紙或棉花團(tuán)的培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋上蓋子，保持在27℃的室溫內(nèi)。30-40min后，在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況。以花粉管長度超過花粉粒直徑為萌發(fā)花粉，統(tǒng)計萌發(fā)花粉粒和視野內(nèi)總花粉粒數(shù)，計算花粉萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢果柱頭可授性

2.1.1 聯(lián)苯胺—過氧化氫法 聯(lián)苯胺過氧化氫法浸沒柱頭后，發(fā)現(xiàn)柱頭表面變成藍(lán)色，氣泡產(chǎn)生不明顯?？赡苁且?yàn)槁?lián)苯胺溶解差，氣泡多寡的統(tǒng)計觀察因人而異。此法用于測定羅漢果柱頭可授性的重復(fù)性差。

2.1.2 MTT（噻唑藍(lán)）染色法 將當(dāng)天上午新鮮柱頭、當(dāng)天下午新鮮柱頭、第二天上午的柱頭、第二天下午的柱頭分別于當(dāng)天上午、當(dāng)天下午、第二天上午、第二天下午浸泡在MTT染色液內(nèi)，觀察柱頭染色的顏色、染色所需時間，比較它們的柱頭活力，判斷柱頭可授性。

從表1可以看到，越新鮮的柱頭，染色所需時間短，藍(lán)黑色染色越深；越不新鮮的柱頭，染色需要的時間越長，染色顏色越淺（見圖1、2）。

從MTT染色法來看，柱頭可授性隨開花時間推移變?nèi)?，與田間授粉結(jié)實(shí)情況相符合。柱頭可授性隨開花時間推移變?nèi)?，開花后第二天下午仍有活性，但活性變?nèi)酢Ｍ瑫r，柱頭活力還受植株情況、天氣情況、植株掛果情況的影響。

2.2 羅漢果花粉活力測定

2.2.1 三種測定方法結(jié)果

（1）醋酸洋紅染色法。染色液與花粉在顯微鏡下，全部顯示出紅色，花粉染色與未染色無區(qū)別（如圖3所示）。不論新鮮花粉還是保存了一年的舊花粉，滴加染色液后視野內(nèi)都是紅色。

（2）TTC染色法。滴入染色液后，經(jīng)過1h、2h，甚至第二天肉眼觀察，染色液仍然呈無色，花粉也沒有變成紅色。在黃色光源顯微鏡下觀察，花粉沒有變成紅色（見圖4）。不論新鮮花粉還是保存了一年的舊花粉，滴加染色液后視野內(nèi)的花粉沒有變色。

（3）離體萌發(fā)法?；ǚ叟囵B(yǎng)溶液30min后開始萌發(fā)花粉管，花粉伸長正常，不破裂，視野干凈清晰，容易計數(shù)（見圖5，表2）。

（4）方法比較。醋酸洋紅染色法不管花粉有無生活力，只要花粉內(nèi)還存在脫氫輔酶存在，都會染上紅色。另外，此法染色花粉與未染色花粉的區(qū)別不大，不適用于羅漢果花粉活力測定。

TTC染色法染色時間過長、染色效果不佳，甚至沒有染色，且TTC染色液有毒，也不適用于羅漢果花粉活力測定。

花粉離體萌發(fā)法，雖然操作復(fù)雜，花粉不易涂抹均勻，統(tǒng)計耗時長，但其測定的數(shù)據(jù)科學(xué)可靠，并可完全定量，是羅漢果花粉生活力測定的首選方法。

2.2.2 離體萌發(fā)法檢測保存花粉的活力 采用萌發(fā)法測定經(jīng)低溫冷藏后的羅漢果花粉活力，見表3。

采用離體萌發(fā)法檢測低溫貯藏花粉的活力，具有數(shù)據(jù)可靠，可以準(zhǔn)確定量羅漢果雄花用量優(yōu)點(diǎn)，效果很好。從表3可以看出，羅漢果雄花經(jīng)低溫保存后，第二天仍能保持相當(dāng)高的活力?；ǚ刍盍牡?d下午開始下降，第4d下午下降最快。表明羅漢果花粉經(jīng)低溫冷藏保存，至第4d仍具有生產(chǎn)使用意義。

3 結(jié)論與討論

3.1 關(guān)于柱頭可授性

檢測羅漢果柱頭可授性，兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：聯(lián)苯胺過氧化氫法是多種植物檢測柱頭可授性的最常用方法，不過聯(lián)苯胺溶解性非常差，藥水配制比較麻煩，氣泡多寡的計數(shù)會因人而異，重復(fù)性比較差；MTT法染色明顯，肉眼可以觀察，染色時間可以確定，簡單快捷，適用于羅漢果柱頭可授性的檢測。

3.2 關(guān)于花粉活力測定

采用的花粉離體培養(yǎng)液，培養(yǎng)離體花粉的最高萌發(fā)率可達(dá)90%甚至更高，接近生產(chǎn)實(shí)際的人工點(diǎn)花平均結(jié)實(shí)率[3]，表明該培養(yǎng)液測定羅漢果花粉活力科學(xué)、有效，是測定羅漢果花粉活力的最適合方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] Dafni A，Maués M M.A rapid and simple procedure to determine stigma receptivity.Sexual Plant Reproduction，1998，11：177-180.

[2] 張妍，楊發(fā)君，田義新.穿龍薯蕷花粉活力及柱頭可授性測定方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：2344-2346.

[3] 廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所.羅漢果栽培與化學(xué)研究[M].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2005.