血清半乳甘露聚糖試驗(yàn)在診斷馬爾尼菲青霉病中的應(yīng)用

嚴(yán)汝帆李鑫壘鄭冬燕林冰梁浩曹存巍(.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧500;.玉林市皮膚病防治醫(yī)院,玉林57000;.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧500)

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血清半乳甘露聚糖試驗(yàn)在診斷馬爾尼菲青霉病中的應(yīng)用

嚴(yán)汝帆1李鑫壘2鄭冬燕1林冰1梁浩3曹存巍1
(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧530021;2.玉林市皮膚病防治醫(yī)院,玉林537000;3.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧530021)

【摘要】目的 評(píng)價(jià)血清半乳甘露聚糖(GM)試驗(yàn)在診斷馬爾尼菲青霉感染(PSM)中的應(yīng)用價(jià)值。方法 收集2012～2015年間確診PSM患者37例、其他真菌感染患者17例、健康志愿者30例血清,進(jìn)行GM試驗(yàn)檢測(cè);同時(shí)評(píng)價(jià)其中4例PSM患者治療前后GM值變化,計(jì)算診斷指標(biāo)并分析評(píng)價(jià)。結(jié)果 GM試驗(yàn)對(duì)PSM患者總體敏感度為78.38%,特異度為82.98%;其中對(duì)HIV陽性PSM患者敏感度為76.47%,特異度為97.87%;對(duì)HIV陰性PSM患者敏感度為75.00%,特異度為84.78%。4例隨訪的PSM患者經(jīng)抗真菌藥物治療后,隨著病情好轉(zhuǎn),GM水平逐漸下降。結(jié)論 GM試驗(yàn)對(duì)PSM有一定的診斷價(jià)值,尤其對(duì)馬爾尼菲青霉流行地區(qū)的HIV感染者,早期診斷PSM有重要意義。

【關(guān)鍵詞】馬爾尼菲青霉病;半乳甘露聚糖試驗(yàn);診斷

[Chin J Mycol,2016,11(1):16-19]

馬爾尼菲青霉病(Penicilliosis marneffei, PSM)是由條件致病菌馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei,現(xiàn)已更名為馬爾尼菲藍(lán)狀菌Talaromyce marneffei)引起的播散性真菌病。該病主要流行于東南亞、我國(guó)的南方,有報(bào)道的廣西PSM患者占全國(guó)51.4%[1]。廣西是全國(guó)AIDS高發(fā)地區(qū), HIV感染人數(shù)位居全國(guó)第2位[2],PSM已成為廣西HIV感染者中僅次于新生隱球菌的第二大機(jī)會(huì)性真菌病[3]。目前診斷PSM確診主要依靠傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng),但該法耗時(shí)長(zhǎng)、易延誤病情、錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)導(dǎo)致病死率高,難以滿足臨床需要。半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)是主要存在于曲霉屬和青霉屬細(xì)胞壁的多糖抗原。利用其高免疫原性抗原的特性,雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)GM已廣泛用于侵襲性曲霉病(Invasive aspergillus,IA)的早期診斷,特別是已在惡性血液病及造血干細(xì)胞移植者的IA早期診斷中獲得認(rèn)可[4]。GM同時(shí)也存在于青霉屬細(xì)胞壁,造成與青霉屬真菌的交叉反應(yīng)。有報(bào)道指出HIV陽性PSM患者血清GM的OD值明顯高于正常值[5-7],提示GM試驗(yàn)可用于HIV陽性PSM患者的診斷[5]。本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)PSM患者血清GM,通過比較其敏感性及特異性,初步確定診斷PSM的最佳陽性界值,并首次比較HIV陽性PSM患者和HIV陰性PSM患者血清GM含量差異,探討GM試驗(yàn)在診斷PSM中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2012～2015年期間于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、百色市人民醫(yī)院確診PSM的37例患者血液標(biāo)本,包括4例不定期復(fù)診患者,其他真菌感染患者17例(包括曲霉感染12例,肺隱球菌病2 例,隱球菌性腦炎1例,口腔念珠菌感染2例)、健康志愿者30例。其中實(shí)驗(yàn)組分為總體PSM患者、HIV陽性PSM患者、HIV陰性PSM患者。對(duì)照組包括其他真菌感染患者及健康志愿者。血液標(biāo)本于確診1周內(nèi)收集,離心分離后存放于EP管中,于-80℃冰箱保存。

健康志愿者入組標(biāo)準(zhǔn):①無畏寒、發(fā)熱、無咳嗽、咳痰等感染癥狀。②無肺部啰音、肝脾腫大、淋巴結(jié)腫大。③白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類正常。④外周血HIV初篩試驗(yàn)為陰性。⑤胸部X線片正常。⑥排除新生隱球菌感染的可能性。⑦追蹤2個(gè)月未發(fā)生曲霉感染。以上條件需同時(shí)滿足。

1.2 方法

通過曲霉菌半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)試劑盒(ELISA法)對(duì)收集到的血清進(jìn)行GM檢測(cè),根據(jù)提供的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)步驟操作。OD值以測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm通過酶標(biāo)儀讀取。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,繪制ROC曲線及采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人口學(xué)資料

總體PSM患者37例,男女比例4∶1,平均年齡41.50歲,其中HIV陽性PSM患者17例,男女比例7∶1,平均年齡40.41歲,HIV陰性PSM患者20例,男女比例7∶3,平均年齡44.37歲。其他真菌感染17例,男女比例12∶5,平均年齡44.76歲。健康志愿者30例,男女比例2∶3,平均年齡42.06歲。

2.2 GM試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組的效能指標(biāo)

通過繪制ROC曲線后(見圖1),如表1所示,總體PSM、HIV陽性PSM、HIV陰性PSM三組診斷界值分別為0.55、1.20、0.55,其中三組ROC曲線下面積(AUC)均于0.7及0.9之間,說明GM試驗(yàn)對(duì)于PSM診斷具有一定準(zhǔn)確性。其中HIV陽性PSM組特異度為97.87%,符合度為90.62%,約登指數(shù)為74.34%,在三組中均表現(xiàn)最好。

2.3 GM試驗(yàn)結(jié)果

如表2所示,GM試驗(yàn)檢測(cè)PSM的平均OD 值(2.915)高于對(duì)照組(0.589)。實(shí)驗(yàn)組中,HIV陽性PSM組平均OD值(4.210)高于總體PSM組及HIV陰性PSM組(1.815)。對(duì)照組中,曲霉病組平均OD值(1.005)高于其余各組,口腔念珠菌感染患者(0.455)、健康志愿者(0.424)平均OD值均小于0.5。

2.4 GM試驗(yàn)對(duì)判斷PSM經(jīng)系統(tǒng)性抗真菌治療效果的價(jià)值

4例PSM患者(HIV陽性1例,HIV陰性3 例)于確診PSM 1周內(nèi)行血清GM檢測(cè),經(jīng)系統(tǒng)抗真菌治療,發(fā)熱、咳嗽、咳痰癥狀好轉(zhuǎn),皮疹消退,X片提示肺部感染好轉(zhuǎn),病情好轉(zhuǎn)出院后不定期復(fù)診并檢測(cè)血清GM。經(jīng)PSM患者經(jīng)系統(tǒng)抗真菌治療后,GM試驗(yàn)結(jié)果呈下降趨勢(shì)。GM試驗(yàn)OD值水平為下降趨勢(shì),與患者病情好轉(zhuǎn)的趨勢(shì)一致。因此,可認(rèn)為連續(xù)監(jiān)測(cè)GM可以有效評(píng)價(jià)對(duì)PSM抗真菌治療的療效。

3 討 論

GM試驗(yàn)已廣泛應(yīng)用于IA的早期診斷,因GM試驗(yàn)對(duì)曲霉屬及青霉屬的交叉反應(yīng)比率高達(dá)73.3%[5],使GM試驗(yàn)診斷PSM成為可能。盡管血液、肺泡灌洗液、尿液、心包積液等多處體液均可作為檢測(cè)GM的樣本,但其他體液GM檢測(cè)由于不同的部位,濃度可比性較差,其敏感性與特異性還沒有一致的共識(shí)。2003年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了血清GM試驗(yàn),但其他部位體液GM檢測(cè)未得到FDA的認(rèn)可。因此,本實(shí)驗(yàn)采用檢測(cè)血清GM,更具有可比性,不受部位不同的影響。

圖1 GM試驗(yàn)診斷總體PSM組(a)、HIV陽性PSM組(b)、HIV陰性PSM組(c)的ROC曲線Fig.1 ROC curves of GM test in diagnosis of total PSM patients,HIV positive PSM patients,HIV negative PSM patients

表1 GM試驗(yàn)對(duì)三組PSM診斷效能Tab.1 Diagnosis performance of GM test for PSM

表2 PSM及對(duì)照組血清GM試驗(yàn)OD值Tab.2 Results of PSM and the control group of GM test

本實(shí)驗(yàn)中,GM試驗(yàn)檢測(cè)PSM平均OD值遠(yuǎn)高于對(duì)照組,其中以HIV陽性PSM組顯著。對(duì)照組中曲霉感染患者組包括8例肺曲霉病患者、4例侵襲性曲霉病患者,其平均OD值高于其余對(duì)照組,但仍低于三組實(shí)驗(yàn)組。目前HIV感染者合并的機(jī)會(huì)性感染仍以結(jié)核分枝桿菌及新型隱球菌為主,而HIV陽性患者合并IA病例鮮有報(bào)道,曲霉病主要仍以肺曲霉病多見,可通過痰培養(yǎng)、典型的影像學(xué)表現(xiàn)等確診[8]。此外新型隱球菌的莢膜含有與GM呈交叉反應(yīng)的抗原表位,GM試驗(yàn)對(duì)新型隱球菌感染也會(huì)呈陽性反應(yīng)[9],對(duì)照組中3例隱球菌感染患者均由隱球菌乳膠凝集實(shí)驗(yàn)確診,其中2例患者的平均OD值大于0.5,考慮與交叉反應(yīng)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)診斷界值為1.20時(shí),HIV陽性PSM組敏感度及特異度分別為76.47%、97.87%,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)對(duì)象均來源于HIV及PSM流行區(qū)域,可知GM試驗(yàn)對(duì)該流行區(qū)域PSM早期診斷有重要意義。

GM被菌絲釋放入血后,并非長(zhǎng)時(shí)間存在,而是很快被分解代謝失去抗原活性。這個(gè)過程受到多種生物學(xué)和流行病學(xué)的因素影響,目前對(duì)這個(gè)過程仍然認(rèn)識(shí)不足[10]。在一些研究中發(fā)現(xiàn)GM在血液中被逐步清除,可能受到腎功能、抗原大小等多種因素的影響[11-12]。紀(jì)宇等[13]研究發(fā)現(xiàn)IA患者在系統(tǒng)抗真菌治療后,GM試驗(yàn)一般在2周左右的時(shí)間轉(zhuǎn)為陰性,并且和療效有著明顯的相關(guān)性。若GM試驗(yàn)長(zhǎng)期持續(xù)陽性,則提示抗真菌治療無效。本實(shí)驗(yàn)對(duì)4例患者PSM經(jīng)系統(tǒng)抗真菌治療好轉(zhuǎn)后出院不規(guī)律復(fù)查血清GM水平,發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療1周后不同時(shí)間檢測(cè)的血清GM水平均小于確診時(shí)的檢測(cè)水平,血清GM變化水平與病情好轉(zhuǎn)的趨勢(shì)吻合。

值得注意的是,多種影響因素均可導(dǎo)致GM試驗(yàn)出現(xiàn)假陽性[14],如釋放入血循環(huán)中的GM并不持續(xù)存在而是會(huì)很快被清除,或患者應(yīng)用抗真菌藥物使真菌生長(zhǎng)速度減慢,菌絲所釋放入體液的GM也隨之減少等均對(duì)臨床診斷形成干擾。臨床工作中可通過患者臨床表現(xiàn)進(jìn)一步排除其他真菌感染的可能性,降低GM試驗(yàn)假陽性的干擾。而GM試驗(yàn)假陰性則可引起漏診、誤診[15],本實(shí)驗(yàn)中有5例PSM患者確診通過組織培養(yǎng)或組織病理,其平均OD值較低,考慮可能與PM未釋放入血循環(huán)或釋放入血循環(huán)后迅速被清除相關(guān)。臨床工作中,患者病情及其他檢查提示PSM可能而GM值較低時(shí),需注意假陰性可能。

GM試驗(yàn)具有快速、無創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn),結(jié)合本實(shí)驗(yàn),證實(shí)GM試驗(yàn)對(duì)PSM具有一定的診斷價(jià)值,尤其是對(duì)HIV陽性的PSM患者診斷效率相當(dāng)高。臨床工作中通過隱球菌乳膠凝集實(shí)驗(yàn)排除隱球菌感染,以及PSM臨床表現(xiàn)(如皮膚表現(xiàn)、骨損害等)進(jìn)一步明確PSM感染,使GM試驗(yàn)對(duì)PSM診斷發(fā)揮更大作用。

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[本文編輯]王 飛

·論著·

The value of the galactomannan antigen assay in diagnosis Penicilliosis marneffei

YAN Ru-fan1,LI Xin-lei2,ZHENG Dong-yan1,LIN Bing1,LIANG Hao3,CAO Cun-wei1
(1.Department of Dermatology and Venereology,The First Affiliated hospital of Guangxi Medical University,Guangxi Key Laboratory of AIDS Prevention and Treatment,Nanning 530021,China;2.Yulin Hospital of Dermatology,Yulin 537000,China;3.Teaching and Research Department of Epidemiology and Health Statistics,Public Health of Guangxi Medical University&Guangxi Key Laboratory of AIDS Prevention and Treatment,Nanning 530021,China)

【Abstract】Objective To evaluate the value of the galactomannan antigen assay in diagnosis Penicilliosis marneffei(PSM).Methods The serum samples were collected from 37 PSM patients,17 other fungal infection patients and 30 healthy volunteers.Platelia Aspergillus enzyme immunoassay kit was used.Results The sensitivities of total PSM patients,PSM patients with or without HIV infection were 78.38%,76.47%,75.00%,while their specificities were 82.98%,97.87%,84.78%,respectively.In 4 follow-up PSM patients,the GM decreased after anti-fungi treatment for 1 week as the clinical presentation improved.Conclusion This study showed that the GM test was significantly elevated for HIV patients with penicilliosis.The use of the GM antigen assay may facilitate earlier diagnosis of Penicillium marneffei infection for HIV-infected patients in areas of endemicity.

【Key words】Penicilliosis marneffei;galactomannan;diagnosis

[收稿日期]2016-01-06

通訊作者:曹存巍,E-mail:caocunwei@yeah.net

作者簡(jiǎn)介:嚴(yán)汝帆,女(漢族),碩士研究生在讀.E-mail:yan7an@ 163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(81571971,81060128,81271804);廣西自然科學(xué)基金(0991144,2012jj AA40175);廣西衛(wèi)生廳自籌課題(Z2007082)

【中圖分類號(hào)】R 446.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-3827(2016)11-0016-04