黃精內生細菌的分離及鑒定

蔡文斌，劉秀麗，黃 娟，趙文娟

（隴東學院生命科學與技術學院/甘肅省隴東生物資源保護利用與生態(tài)修復重點實驗室，甘肅 慶陽 745000）

雞頭黃精（Polygonatum sibiricum）是百合科黃精屬（PolygonatumMill.）多年生草本植物。黃精主要藥物化學成分是黃精多糖、甾體皂苷、黃酮等［1］，藥理作用主要為保護心臟、降血糖血脂、提高免疫力、保護心血管、延緩衰老、消炎抗病毒、抗腫瘤等［2］。黃精作為一種重要的藥食同源植物，因其市場需求量越來越大，價格不斷上漲，山區(qū)人民加大對野生黃精的采挖，致使其產(chǎn)量降低，處于供不應求的狀態(tài)。盡管在政府的支持下，中藥材種植業(yè)逐漸發(fā)展壯大，但黃精種植困難重重［3］，產(chǎn)量依然低下。因此若能找到一種與黃精同效且易獲得的替代物，將具有重大意義，為黃精內生菌的發(fā)現(xiàn)提供了新思路。

內生菌普遍存在于健康植物組織中，與植物共生，能產(chǎn)生與植物相同或相似的代謝產(chǎn)物。藥用植物內生菌種類豐富，代謝產(chǎn)物多樣，主要有生物堿、皂苷類、萜類、芳香類、多肽類等化合物。孫紅敏等［4］從蛇足石杉分離到可抗菌、抗病毒的內生菌；趙明等［5］從華重樓中分離到能產(chǎn)生重樓甾體皂苷成分的內生細菌，而重樓甾體皂苷在抗腫瘤方面有重要的作用；曲紅光等［6］從人參內生細菌代謝產(chǎn)物中檢測到了具有抗腫瘤活性的物質。郭曉平等［7］從泰山黃精塊莖組織分離到一株具有廣譜抗菌活性的內生細菌；柏曉輝等［8］從黃山野生黃精的根莖組織中篩選到一株具有抑菌活性的內生細菌；遲惠榮等［9］從多花黃精的根、莖、葉內分離到對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的菌株。因此，藥用植物產(chǎn)活性成分內生菌的分離鑒定及有藥用價值代謝產(chǎn)物的開發(fā)，用來彌補天然中藥材短缺問題不失為一種有效的途徑。

本研究以隴東子午嶺自然保護區(qū)多年生野生雞頭黃精為材料，從中分離出具有抑菌活性的內生細菌，并篩選遺傳穩(wěn)定、多糖含量高的優(yōu)質菌株，通過分子生物學手段進行種屬鑒定分析，力求為隴東地區(qū)黃精內生菌的開發(fā)與利用提供理論基礎，同時也為野生中藥材的保護及替代資源的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 試驗用雞頭黃精采自隴東地區(qū)子午嶺自然保護區(qū)，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由慶陽市疾控中心實驗室提供并于隴東學院生命科學與技術學院微生物實驗室保存。

1.1.2 試驗儀器 System 9700型PCR（美國ABI公司），SIGMA3K30型冷凍離心機（德國SIGMA公司），SW-CJ-ID型超凈工作臺（上海蘇凈實業(yè)有限公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱、BPG-9140A型精密鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），LDZX-30KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），BSD-100型振蕩培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），MDF-U3386S型三洋超低溫保存箱（日本三洋有限公司）。

1.1.3 試驗試劑 蛋白胨、酵母提取物、無水乙醇、無水葡萄糖、牛肉膏、十二烷基磺酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等試劑均為國產(chǎn)分析純，2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、小量DNA純化回收試劑盒（離心柱型）、限制核酸內切酶、pUCm-T載體、離心型質粒提取試劑盒均購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 內生菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂粉15 g/L，調節(jié)pH到7.2～7.4，高壓蒸汽滅菌鍋（121℃，20 min）進行滅菌；金黃葡萄球菌培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L、牛肉膏5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂粉17 g/L，后續(xù)按照“內生菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基”方法處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃精內生菌的分離及純化 采用組織塊培養(yǎng)法［8，10］分離黃精內生菌，簡述如下。將剛采挖回來優(yōu)質的黃精塊莖表面泥土用洗衣粉洗凈，并用流水沖洗黃精塊莖表面1 h，將沖洗后的黃精塊狀莖放入已滅菌的100 mL的三角瓶中，在超凈工作臺里用75%乙醇浸泡2 min，瀝去75%乙醇溶液后用無菌水沖洗5次，再用0.1%HgCl2溶液處理8 min，瀝去HgCl2溶液后用無菌水沖洗6次并吸去殘留的無菌水，用無菌刀片將黃精塊莖切成1 cm3左右的塊狀，放入LB固體培養(yǎng)基分離內生菌，同時將最后一次沖洗的無菌水作為對照。將培養(yǎng)皿于30℃恒溫下培養(yǎng)2～3 d，觀察到試驗組黃精塊莖切口處長出菌落后，用接種環(huán)挑取菌體在LB固體培養(yǎng)基上進行純化，純化3次后的菌落認定為純種，將純種黃精內生菌保存在LB斜面培養(yǎng)基上，置于4℃下冷藏備用。

1.2.2 內生菌發(fā)酵及發(fā)酵產(chǎn)物抑菌分析

1）內生菌發(fā)酵液的制備。取保存的純種內生菌，挑取少量菌種使用平板劃線法接種至新鮮LB培養(yǎng)基上，30℃活化培養(yǎng)12～16 h，挑取活化的單菌落轉接至新鮮配制的LB液體培養(yǎng)基，在恒溫搖床30℃230 r/min培養(yǎng)12～16 h得到種子液。移取2 mL種子液至100 mL新配制LB液體培養(yǎng)基，于恒溫搖床中30℃180 r/min培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結束后，對發(fā)酵液以8 000 r/min離心5 min，取離心后的上清液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮并用無菌水定容至10 mL，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，將過濾所得的發(fā)酵液進行抑菌試驗。

2）瓊脂打孔法對內生菌發(fā)酵液進行抑菌分析。參考張昊等［11］關于金黃色葡萄球菌的研究，本試驗采用瓊脂打孔法［12］進行抑菌活性檢測。

1.2.3 黃精內生菌分子生物學鑒定

1）黃精內生菌基因組的提取?；蚪M的提取，采用熊明華等［13］的SDS基因組DNA提取方法，并稍作改良。

2）16SrDNA的克隆。使用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對所提取的黃精內生菌基因組DNA進行16SrDNA PCR克隆。PCR體系如表1所示，PCR循環(huán)體系如表2所示。PCR擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，對PCR擴增產(chǎn)物使用柱式DNA膠回收試劑盒回收。

表1 黃精內生菌16Sr DNA PCR反應體系

表2 黃精內生菌16Sr DNA PCR循環(huán)體系

3）16SrDNA重組克隆載體的構建及酶切鑒定?；厥盏腜CR產(chǎn)物連接pUCm-T載體，高效大腸桿菌感受態(tài)細胞轉化，篩選陽性克隆及提取重組質粒，采用酶切體系20μL（重組質粒：5μL，EcoRⅠ0.9μL，PstⅠ0.9μL，ddH2O 13.2μL）鑒定陽性克隆。

4）陽性克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育分析。將酶切鑒定為陽性克隆的菌株送生工生物工程公司測序，將測得的16SrDNA序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，檢索其同源序列。選擇與目標菌株同源性較高的菌株序列，用軟件DNAMAN 9.0進行序列分析，軟件MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹［14］。

5）內生菌發(fā)酵產(chǎn)物多糖含量測定。采用苯酚-濃硫酸法測胞外多糖的含量［15］，并與其寄主黃精多糖含量進行比較。

標準曲線的制備：精密稱取于105℃下干燥至恒重的葡萄糖對照品100.0 mg，溶于100.0 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。再吸取5.0 mL溶于25.0 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。分別精密吸取葡萄糖對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于帶試管塞的試管中，各加入去離子水補至1.0 mL，加入5%苯酚1.0 mL，搖勻，快速加入濃硫酸5.0 mL，混勻，置于85℃中加熱20 min，取出，在常溫水中冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度A，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度A為縱坐標，建立回歸方程。

黃精多糖提?。簠⒖嘉墨I［16］，把采集的多年生新鮮黃精塊莖清洗干凈，切片，于干燥箱中60℃恒溫干燥至恒重，研磨成粉，過60目篩。稱取10 g溶于pH 5.0的檸檬酸緩沖液中，加入4%纖維素酶，于60 Hz頻率、60℃條件下超聲提取55 min，過濾，取上清液，真空濃縮至20 mL以下，以4倍無水乙醇沉淀，干燥得固體樣品。

內生菌多糖提?。簝壬l(fā)酵液以8 000 r/min離心5 min取上清液，以4倍體積無水乙醇于4℃條件下沉淀上清液24 h，8 000 r/min離心5 min取沉淀，并將沉淀于65℃恒溫箱中烘干，研磨成粉狀備用。

多糖含量測定：把黃精多糖粗提物和內生菌發(fā)酵產(chǎn)物多糖粗提物稀釋一定倍數(shù)于490 nm處測定吸光度A，根據(jù)回歸方程計算樣品中多糖含量。

2 結果與分析

2.1 黃精內生菌的分離及抑菌分析

從黃精塊莖中共分離到4株內生細菌，編號分別為H-1、H-2、H-3、H-4。按照“1.2.2”方法制備發(fā)酵濃縮液并對金黃色葡萄球菌進行抑菌檢測，檢測結果見圖1。從圖1可以看出，H-3抑菌活性最強，其抑菌圈大小約為16.60 mm，抑菌時間長達72 h以上。H-3菌落形態(tài)特征為：菌落小、不規(guī)則、干燥、白色、透明，經(jīng)革蘭氏染色法鑒定為革蘭氏陽性菌。

圖1 4株內生菌的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.2 內生菌H-3的16S rDNA克隆及酶切鑒定

采用改良的SDS法提取黃精內生菌H-3基因組，克隆16SrDNA PCR，用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR克隆產(chǎn)物檢測（圖2），結果顯示克隆到1 500 bp左右的條帶。把此條帶經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收，連接pUCm-T載體，并轉化大腸桿菌感受態(tài)，提取重組質粒，用限制內切酶酶切體系鑒定，結果如圖3所示。由圖3可以看出，酶切產(chǎn)物與克隆產(chǎn)物基本一致。

圖2 H-3菌株16Sr DNA PCR擴增產(chǎn)物電泳結果

圖3 H-3菌株16Sr DNA重組質粒酶切產(chǎn)物電泳結果

2.3 黃精內生菌H-3的系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序后的序列用DNAMAN 9.0進行拼接，將拼接結果提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫上做BLAST序列比對，發(fā)現(xiàn)菌株H-3與菌株Bacillus circulansstrain S1（GenBank號：MK100762.1）和菌株Bacillus circulansstrain 194Fe（GenBank號：KM349200.1）序列的相似度達到98.28%，基本鑒定為芽孢桿菌。利用軟件MEGA7.0中的p-distance模型計算進化距離，用鄰接法Neighbor-Joining構建系統(tǒng)發(fā)育樹，隨機抽樣1 000次，自展法計算進化樹的置信度，進化發(fā)育樹如圖4所示。從進化樹分析結果可以看出，H-3與菌株Bacilluscirculansstrain S1和菌株Bacilluscirculansstrain 194Fe在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支上，結合菌落形態(tài)和革蘭氏染色等結果，可將該菌鑒定為環(huán)狀芽孢桿菌（Bacilluscirculans）。

圖4 內生菌H-3及其同源菌株的系統(tǒng)進化樹

2.4 黃精內生菌H-3發(fā)酵產(chǎn)物多糖含量測定

通過對菌株H-3發(fā)酵培養(yǎng)，獲取發(fā)酵產(chǎn)物多糖粗提物，利用苯酚-濃硫酸法測定多糖含量。標準曲線回歸方程為Y=0.004X-0.007（R2=0.998 6），表明在0～200μg/mL，吸光度A與葡萄糖濃度有著良好的線性關系。雞頭黃精的多糖含量達31.40%，內生菌H-3發(fā)酵液醇提物多糖含量為24.00%。

3 小結與討論

從隴東地區(qū)的野生雞頭黃精中分離到4株內生菌，通過對其進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌性，篩選出菌株H-3，結合菌落形態(tài)、革蘭氏染色、系統(tǒng)進化分析，可初步鑒定H-3為環(huán)狀芽孢桿菌。本研究是首次關于隴東地區(qū)黃精內生菌的研究報道，其他地區(qū)關于黃精內生菌有相關的研究［7-9］。從黃精內生菌現(xiàn)階段研究情況看，黃精中普遍存在芽孢桿菌屬內生菌，可以篩選到代謝產(chǎn)物具有抑菌活性的菌株。

金黃色葡萄球菌無芽孢、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏陽性菌，是一種重要的致病病原體。胡嵐等［17］對2015—2019年首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院感染革蘭陽性菌菌株分布及耐藥性分析中發(fā)現(xiàn)，5年臨床檢測分析了8 406株革蘭陽性菌，其中有1 785株是金黃色葡萄球菌。在中國CHINET數(shù)據(jù)監(jiān)測網(wǎng)中，統(tǒng)計2019年中國醫(yī)院內住院的感染患者數(shù)據(jù)［18］，發(fā)現(xiàn)陽性菌主要以金黃色葡萄球菌、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）為主。而在CHINET的數(shù)據(jù)中顯示金黃色葡萄球菌占總分離細菌中的9.34%，進而表明金黃色葡萄球菌是主要的致病菌，因此本研究采用金黃色葡萄球菌作為致病菌進行抑菌分析。在接下來的工作中，隴東地區(qū)藥用植物研究團隊將在抑菌成分結構的解析、內生菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化、抑菌產(chǎn)物的分離純化等方面繼續(xù)研究，期望能促進黃精內生菌有價值產(chǎn)物的開發(fā)與利用。