反丁烯二酸酯類物質結構與抑菌性能關系

邱松山，姜翠翠，周如金，劉杰鳳

（廣東石油化工學院果蔬加工與貯藏工程中心，廣東 茂名 525000）

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反丁烯二酸酯類物質結構與抑菌性能關系

邱松山，姜翠翠，周如金，劉杰鳳

（廣東石油化工學院果蔬加工與貯藏工程中心，廣東 茂名 525000）

摘要：采用密度泛函理論（DFT）考察反丁烯二酸酯類化合物結構與抑菌活性之間的定量構效關系（QSAR）。在B3LYP/6-311++ G(d)基組下對13種反丁烯二酸酯類化合物進行幾何構型優(yōu)化和頻率計算，選取最高占據軌道能量EHOMO、最低空軌道能量ELUMO及兩者的絕對差值?E、偶極矩(μ)、零點能、平均分子極化率(p)等量化參數作為量子化學描述符，通過多元逐步回歸分析篩選影響抑菌活性的主要因素并建立化合物量化參數和抑菌活性之間的QSAR模型方程，并用留一法交叉驗證模型的穩(wěn)定性及預測能力。結果表明反丁烯二酸酯類化合物抑制枯草芽孢桿菌性能與其結構參數?E、μ、ZPE之間存在著較高的線性關系，?E和μ越大，抑菌活性越大，相關系數R=0.957，此類化合物抑制枯草芽孢桿菌活性的理論值與實驗值的相關性良好，表明該模型能較好的預測此類具有α,β-不飽和羰基母體結構的反丁烯二酸酯類化合物的抑菌活性。

關鍵詞：反丁烯二酸酯類化合物；構效關系；抗菌活性；計算機模擬；構型優(yōu)化；外部預測

反丁烯二酸酯類防腐劑是目前使用非常廣泛的一類抑菌劑，具有使用方便、無殘毒、生產成本低、價格便宜等特點，是目前飼料、谷物較為理想的防霉抑菌劑。具有α,β-不飽和羰基母體結構的反丁烯二酸單甲酯（MMF）、反丁烯二酸二甲酯（DMF）、反丁烯二酸單乙酯（MEF）、反丁烯二酸單丁酯（MBF）、反丁烯二酸單辛酯（MOF）等抑菌作用突出[1]。食品防腐劑分子結構與活性之間關系的研究一直是一個受關注的課題，研究表明通過對不同濃度的MMF、MEF、MBF的抑菌效果的比較，5種反丁烯二酸單酯對11種常見霉菌都有一定的抑菌作用，其中對青霉的抑菌效果較好，對木霉、曲霉、根霉也有較好的抗菌效果[2]。周常義等[3]研究表明，離子型反丁烯二酸單甲酯對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為 0.06g/L，現有的研究均表明非對稱反丁烯二酸酯類是一類具有良好防霉抗菌性能的化合物，對霉菌、酵母菌具有較好的抗菌效果。

防腐劑的抑菌性能本質上取決于化合物的量子生物化學特性，探討反丁烯二酸酯類防腐劑的量子化學與抑菌活性之間的關系及其抑菌機制有著重要的理論意義和實踐意義[4-5]。定量結構-活性關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）的發(fā)展非常迅速，結合實驗數據通過數學模型定量描述化合物的分子結構、理化性質和活性之間的關系，從而能夠建立化合物結構與活性-性質之間的數學模型[6]。邱松山等[7]分析了具有抗菌活性的11種對羥基苯甲酸酯類化合物的定量構效關系，結果表明化合物的最低空軌道能量、偶極距和極化率是影響對羥基苯甲酸酯類化合物抗菌活性的主要因素。郭新竹等[8]對丁烯二酸酯類分子的偶極矩、能量等量子生物化學特性進行計算，并對17種含α,β-不飽和羰基結構的分子連接性指數與抗菌活性進行回歸分析，結果表明抑菌效果與抑菌劑的分子前線軌道能量的絕對值成反比，抑菌能力與抑菌劑的最高占有軌道能量呈顯著的直線回歸關系，且不飽和結構及其雜原子在發(fā)揮抗菌功能中起著重要的作用。周如金等[9]對目標化合物分子的量子化學參數進行優(yōu)化篩選，結果表明含α,β-不飽和羰基結構的化合物周邊的分子碎片對抗菌活性影響較大。ZHU等[10]和TRESADERN等[11]分別通過對含α,β-不飽和羰基結構的防腐劑分子的拓撲參數和量子化學參數進行線性回歸，獲得此類化合物的定量結構與抑菌活性之間的QSAR關系模型，該模型表明此類防腐劑持久的抑菌性能主要取決于防腐劑容納電子的能力，因此探討反丁烯二酸酯類化合物結構與生物活性的QSAR模型可大大增加對其分子抑菌活性機制的解釋，從而為更高效的抑菌劑開發(fā)奠定基礎。本文采用Gaussian 09軟件對13種反丁烯二酸酯類化合物的分子構型進行結構優(yōu)化與頻率分析，在6-311++G(d)基組的水平下對其分子和相應的基團進行計算，用密度泛函理論（DFT）建立反丁烯二酸酯類化合物量化參數和抑菌活性之間的QSAR模型，在穩(wěn)定構型下得到反丁烯二酸酯類化合物抗大腸桿菌活性間的構效關系，為研究新型高效反丁烯二酸酯類抑菌物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

756PC分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司，SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司，LS-50HD數顯壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；NRY-1102C立式恒溫搖床，上海南榮實驗室設備有限公司，FE20K酸度計，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司。

葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、二甲基亞砜等為分析純試劑，牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉等為生化試劑；所用水為去離子水，滅菌后使用。

1.2 最低抑菌濃度（MIC）分析

供試菌種：枯草芽孢桿菌（B. subtilis ATCC 6633）：由廣東石油化工學院生物實驗室提供，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，菌種使用前在固體培養(yǎng)基上活化一次。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化鈉0.5%，pH=7.0～7.2。細菌固體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基則添加2%的瓊脂，培養(yǎng)基在使用之前121℃滅菌20min，待用。

供試的15種反丁烯二酸酯類化合物如表1所示，使用前配成1.00mg/mL溶液。

菌懸液的制備：枯草芽孢桿菌（B. subtilis）在30℃培養(yǎng)24h，之后稀釋至0.5麥氏比濁度（OD625nm= 1.1～1.3），用培養(yǎng)基將菌懸液以1∶50稀釋至最終濃度104CFU/mL。

最低抑菌濃度（MIC）測定：參考文獻[12]的方法進行，將反丁烯二酸酯類樣品溶于DMSO中，倍比稀釋，然后加入菌懸液中，使之最終濃度為1.00mg/mL，37℃恒溫培養(yǎng)48h，DMSO在培養(yǎng)基中的最終濃度不超過2%，強光清澈透明、無可見微生物生長，化合物最低濃度即為MIC，試驗重復3次。

表1 反丁烯二酸酯類化合物一覽表

1.3 量化方法和量化參數

采用Gaussian 09量子化學程序包[13]中的密度雜化泛函B3LYP方法，在6-311++ G(d)基組下優(yōu)化13種反丁烯二酸酯類化合物的幾何構型和頻率計算，選取主要反映分子特征結構的最高占據軌道能量EHOMO、最低空軌道能量ELUMO及兩者的絕對差值?E作為表征分子間相互作用的參數，選取衡量分子極性的偶極矩(μ)、零點能（zero-point energy，ZPE）、平均分子極化率(p)等6個量化參數研究反丁烯二酸酯類化合物結構與抑菌活性之間的關系，幾何構型優(yōu)化均收斂，經頻率分析表明無虛頻。反丁烯二酸酯類化合物的抗菌最低抑菌濃度lg(1/MIC)及量子化學參數值見表2。

2 結果與分析

2.1 量化參數選擇

選取13種反丁烯二酸酯類化合物的lg(1/MIC)作為活性參數，應用SPSS軟件分析相關化合物的抑菌活性lg(1/MIC)與量化計算所得的參數之間的相關性，結果如表3所示。

由表3可知，反丁烯二酸酯類化合物抑菌活性lg(1/MIC)與?E、μ、p、ZPE等的相關系數較大，與ZPE成負相關，與?E、μ成正相關。

2.2 定量構效關系（QSAR）

QSAR研究主要從化合物結構出發(fā)，結合生物活性實驗數據建立二維或多維函數關系，揭示分子結構與其活性間的構效關系，從而為新分子的設計及評價提供理論依據[14]，本文在95%置信區(qū)間內應用SPSS軟件對抑菌活性和量化參數進行逐步回歸分析，獲得抑菌活性lg(1/MIC)和各量化參數之間的最佳模型方程。

表2 B3LYP/6-311++G(d)基組下反丁烯二酸酯類化合物的抑菌活性及量化參數

表3 反丁烯二酸酯類化合物的抑菌活性與量化指數的相關系數

lg(1/MIC) = 30.578×?E+0.014×μ?0.019×ZPE

R=0.957，R2=0.916，R2aj=0.929，F=32.099，n=13，Sig.<0.000

由該QSAR方程可知，所研究的反丁烯二酸酯類化合物的抑菌活性lg(1/MIC)與其結構參數?E、μ、ZPE之間存在著較高的線性關系。?E和μ越大，抑菌活性越大，相關系數R=0.957，表明該模型能較好地預測此類具有α,β-不飽和羰基母體結構的反丁烯二酸酯類化合物的抑菌活性。

2.3 分子結構對抑菌活性的影響

研究表明反丁烯二酸酯類防腐劑抑菌作用依賴于化合物基團的空間立體特性，只有化合物抑菌活性中心與微生物生命分子的活性功能域發(fā)生有效接觸，反丁烯二酸酯類化合物才能發(fā)揮抗菌作用。在分子間的自由碰撞過程中，化合物反應活性中心周圍空間位阻愈小，抑菌活性中心原子發(fā)生有效碰撞的概率就愈大，其抗菌活性相對愈強[8，15]。寧正祥等[15]研究表明，反丁烯二酸酯類化合物結構中含有α,β-不飽和羰基結構，具有電子中繼系統(tǒng)且羰基電子與相鄰烯鍵電子間形成共軛效應，具有強的電子緩沖能力；此外，反丁烯二酸酯類的抑菌活性比相應的順式構型的丁烯二酸酯類高幾倍，表明影響抑菌劑抑菌效果發(fā)揮的首要因素是空間位阻效應，并決定了抑菌劑分子中的反應活性中心直接與菌體中的受體部位發(fā)生有效碰撞的頻率占抗菌劑分子與受體總碰撞頻率的比例[16]有關。能量最高的占據軌道HOMO和能量最低的空軌道LOMO統(tǒng)稱為前線分子軌道，不同化合物分子參與反應的HOMO與LUMO的能量越接近，相互作用越強，體系就越穩(wěn)定；HOMO和LUMO重疊越大，分子間形成的鍵就越牢固，化合物表現出的生物活性就越大[11，17]。反丁烯二酸酯類化合物分子中電子得失和轉移能力主要取決于HOMO和LUMO能量，不同分子的抑菌活性受能量差?E的影響較大，此類化合物中羧基酯化后親脂性比母體分子增強，其抑菌性能與化合物的分子結構有較大關聯，抑菌性能本質上取決于防腐劑與微生物作用時的電子行為，由所建立的QSAR方程可知，反丁烯二酸酯類化合物的抑菌活性與分子的?E和μ呈正相關性，在反丁烯二酸類物質的骨架引入極性供電子基對分子發(fā)揮抑菌作用是有利的，這為更具抑菌活性的反丁烯二酸酯類化合物的設計奠定了基礎。

2.4 QSAR模型驗證

反丁烯二酸酯類化合物抑菌活性lg(1/MIC)實驗值與理論值的相關性及殘差如圖1和圖2所示。由圖1、圖2可知，化合物抑菌活性lg(1/MIC)理論值與實驗值的相關性良好，且其殘差值以0為中心符合正態(tài)分布。

采用方差膨脹因子（VIF）[7]評價所建立的QSAR模型中各自變量的共線性，結構參數?E、μ、ZPE的平均VIF為2.976，表明樣本對回歸模型結果的穩(wěn)定性和可靠性影響較小，相關參數的選取可靠。

2.5 QSAR模型的外部預測

圖1 lg(1/MIC)理論值與實驗值的相關性

圖2 13種反丁烯二酸酯類化合物lg(1/MIC)殘差分布

選取所測13種以外的2種反丁烯二酸酯類化合物GMF和GAMF對所建立的QSAR模型進行外部預測，GMF和GAMF抑菌活性lg(1/MIC)采用1.2節(jié)的方法進行，分析計算值和實驗測定值的殘差結果如表4所示，計算值與測定值基本符合。

表4 根據模型計算所得數據和殘差表

3 結 論

在B3LYP/6-311++G(d)水平上對具有抑菌活性的13種反丁烯二酸酯類化合物進行構型優(yōu)化和頻率計算，逐步回歸分析篩選影響抗大腸桿菌活性的主要參數，建立反丁烯二酸酯類化合物抑制枯草芽孢桿菌的QSAR方程：

lg(1/MIC) = 30.578×?E+0.014×μ－0.019×ZPER2=0.916，R2aj=0.929

反丁烯二酸酯類化合物抑制枯草芽孢桿菌活性lg(1/MIC)與其結構參數?E、μ、ZPE之間存在著較高的線性關系，?E和μ越大，化合物抑菌活性越大，所建立的模型驗證表明反丁烯二酸酯類化合物抑制枯草芽孢桿菌活性lg(1/MIC)的理論值與實驗值的相關性良好，該模型能較好地預測此類具有α,β-不飽和羰基母體結構的反丁烯二酸酯類化合物的抑菌活性。

參 考 文 獻

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研究開發(fā)

Relationship between antibacterial activity and structure of fumaric acid esters

QIU Songshan，JIANG Cuicui，ZHOU Rujin，LIU Jiefeng
（Development Centre of Technology for Fruit & Vegetables Storage and Processing Engineering，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China）

Abstract：The quantitative structure-activity relationship (QSAR) between molecular structures and antibacterial activity of fumaric acid esters was studied using the density functional theory (DFT) at the B3LYP functional at the level of 6-311++G(d) basis set. The energy of the highest occupied molecular orbital EHOMO，the energy of the lowest unoccupied molecular orbital ELUMO，the difference of energy ?E，the dipole moment μ，the zero-point energy (ZPE) and the average molecular polarizability (p) were selected as the structural descriptors. The geometries and the QSAR model of the samples were optimized and the stable complexes were obtained. The stability and predictive ability of the model were examined by the “l(fā)eave-one-out” cross-validation method．The results suggest that the dipole moment μ，?E and zero-point energy are the predominant factors affecting the antibacterial activity against B. subtilis. The antifungal activity increases with the increase of ?E and μ. The obtained QSAR model has a good stability and predictive ability for such inhibitors.

Key words：fumaric acid esters; structure-activity relationship; antibacterial activity; computer simulation；structure optimization; outer prediction

收稿日期：2015-06-17；修改稿日期：2015-09-01?；痦椖浚簭V東省部產學研結合項目（2013B090600032）、茂名市科技計劃（2014007）及果蔬加工與貯藏工程中心開放基金（2015A005）項目。第一作者：邱松山（1978—），男，博士，副教授。聯系人：周如金，博士，教授。E-mail tustqss@163.com。

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.03.035

中圖分類號：TS 201.2

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）03–0879–05