大腸埃希菌生物被膜形成能力測定及其耐藥性分析

易彩虹，劉德夢（天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津300；天津醫(yī)院）

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大腸埃希菌生物被膜形成能力測定及其耐藥性分析

易彩虹1，劉德夢2
（1天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津300211；2天津醫(yī)院）

摘要：目的 建立大腸埃希菌生物被膜體外形成模型，觀察菌株的生物被膜形成能力及其耐藥性。方法 收集臨床標本中分離的大腸埃希菌82株，采用平板培養(yǎng)法構(gòu)建細菌生物被膜的體外模型，用結(jié)晶紫染色法檢測生物被膜形成能力，比較氨芐西林、頭孢噻肟、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星對菌株的最低抑制濃度（MIC）和生物被膜抑制濃度（BIC）。結(jié)果 82株菌株均形成生物被膜，其中11株生物被膜形成能力為弱陽性，68株為陽性，4株為強陽性。42株生物被膜形成能力為陽性的菌株，對氨芐西林、頭孢噻肟、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為80．9%、45．2%、26．2%、35．7%、45．2%。形成生物被膜后，抗菌藥物對細菌的BIC50、BIC90均大于相應(yīng)的MIC50、MIC90。結(jié)論 大部分臨床分離的大腸埃希菌有形成生物被膜的能力，形成生物被膜后菌株耐藥性增強。

關(guān)鍵詞：大腸埃希菌；生物被膜；耐藥性；最低抑菌濃度；生物被膜抑制濃度

大腸埃希菌是常見的院內(nèi)感染細菌之一，附著于生物材料表面能形成生物被膜，抗菌藥物常規(guī)劑量通常無法滲透生物被膜，導致感染反復(fù)發(fā)作［1，2］。相同條件下不同細菌形成的生物被膜的量不同，被膜越多對抗菌藥物的抗性越強［3］。如何有效突破細菌生物被膜的保護作用殺滅細菌，對于治療產(chǎn)生物被膜菌株引起的感染非常重要［4］。本研究通過構(gòu)建細菌生物被膜的體外模型，比較抗菌藥物氨芐西林、頭孢噻肟、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星的最低抑菌濃度（MIC）和生物被膜抑制濃度（BIC），觀察生物被膜形成能力，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1　材料與方法

1．1菌株來源 選擇2014年3～11月天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院臨床標本中分離的大腸埃希菌82株，其中分離自尿液20株、糞便62株。質(zhì)控菌株ATCC25922，為天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院感染研究所保存。所有菌株經(jīng)常規(guī)生化鑒定證實為大腸埃希菌。

1．2菌株生物被膜形成能力測定 采用結(jié)晶紫染色法［5］。隔夜培養(yǎng)大腸埃希菌菌液，調(diào)至0．5麥氏比濁度，按1∶20比例稀釋后加入96孔板，空白對照孔只加培養(yǎng)液。35℃孵箱中培養(yǎng)24 h，生理鹽水沖洗。每孔加250 μL甲醇固定15 min，棄菌液風干，加入150 μL結(jié)晶紫室溫下染色15 min，生理鹽水沖洗后風干。每孔中加入250 μL 36%冰醋酸，10 min后測吸光度（OD）值，以上步驟重復(fù)3次取平均值。以陰性對照孔3次OD值平均值的標準差的3倍作為臨界值（ODC）。生物被膜形成能力的判斷標準為：OD≤ODC為陰性，ODC＜OD≤2×ODC為弱陽性，2×ODC＜OD≤4×ODC為陽性，OD＞4×ODC為強陽性。選擇生物被膜形成能力占主要地位的菌株用于MIC和BIC檢測。

1．3MIC檢測 采用微量肉湯稀釋法測定大腸埃希菌對氨芐西林、頭孢噻肟、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星5種抗菌藥物的MIC。方法參照CLSI （2014年）臨床微生物實驗室標準，并按照其標準判斷藥敏結(jié)果。

1．4BIC檢測［6，7］將0．5麥氏比濁度的大腸埃希菌菌液按1∶20比例稀釋后加入96孔板。將接種器插入細胞培養(yǎng)板的孔中，35℃培養(yǎng)24 h后取出，轉(zhuǎn)入96孔藥敏板中，35℃培養(yǎng)20 h后取出，轉(zhuǎn)入含100 μL LB肉湯的96孔板中，20 min內(nèi)在超聲震蕩儀中震蕩。然后放入35℃孵箱中培養(yǎng)6 h后取出，測量OD值?？咕幬锏腂IC為低于陽性對照孔OD平均值10%的抗菌藥物濃度，依據(jù)CLSI（2014年）臨床微生物實驗室標準進行分析。

2　結(jié)果

2．1生物被膜形成能力檢測結(jié)果 82株菌株均有生物被膜形成，弱陽性11株（13%），陽性68株（82%），強陽性4株（5%）。質(zhì)控菌株生物被膜形成能力為陽性。

2．2MIC與BIC比較 從68株產(chǎn)生物被膜能力陽性的大腸埃希菌中抽取42株進行MIC和BIC測定。42株菌株對氨芐西林、頭孢噻肟、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為80．9%、45．2%、26．2%、35．7%、45．2%；其中多重耐藥17株，占40．4%。5種抗菌藥物對42株菌株的BIC50和BIC90均較MIC50和MIC90高。見表1。

表1　5種抗菌藥物對42株大腸埃希菌的MIC和BIC（μg／mL）

3　討論

通常情況下，大腸埃希菌屬于腸道正常菌群。當機體免疫力低下、侵入性操作較多時，其可引起泌尿道、術(shù)后傷口等不同部位的感染。隨著抗菌藥物的濫用，其耐藥率愈來愈高［8］。既往研究顯示，大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率不斷提高［9］，大腸埃希菌耐藥情況嚴峻。

很多抗生素的臨床用藥指南是針對浮游微生物的，但是在環(huán)境中，包括大腸埃希菌在內(nèi)的大多數(shù)微生物是以集落或者生物被膜的形式存在的［10］。β-內(nèi)酰胺酶、外排泵和細菌耐藥片段的突變這三種耐藥機制均與生物被膜的存在有關(guān)。生物被膜中的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣含量可影響生物被膜中的細菌代謝，從而影響細菌對藥物的敏感性。而且在抗生素的持續(xù)作用下，大腸埃希菌能夠形成生物被膜以逃避機體的免疫清除，從而導致多種抗生素耐藥［11］。生物被膜既是細菌致病機制又是臨床治療失敗的原因之一［12］。相同條件下，不同細菌形成生物被膜的能力是不同的。細菌鞭毛和菌毛使得其易于黏附于固體表面（如導尿管、氣管插管等），增加了形成生物被膜的機會［13］。本研究中，82株菌株均形成了生物被膜，而大部分菌株產(chǎn)生生物被膜的能力中等。生物被膜既能夠阻止抗生素的穿入，又能限制細菌的營養(yǎng)供給，使細菌生長減慢，降低其對抗菌藥物的敏感性。形成生物被膜的量越大，對抗生素的抗性越強［14］。此外，生物被膜還可向周圍環(huán)境緩慢釋放浮游菌，成為潛在的感染源［15］，導致細菌感染難以治愈或反復(fù)發(fā)作。本研究對大腸埃希菌的BIC測定結(jié)果顯示，每種抗生素的BIC50和BIC90均高于相應(yīng)的MIC50和MIC90。表明形成生物被膜后細菌耐藥性大大增加。其中氨芐西林耐藥的菌株達100%，左氧氟沙星耐藥菌株菌株也超過65%。提示在大腸埃希菌感染形成生物被膜后，單獨應(yīng)用上述抗菌藥物可能使治療失敗，故臨床治療已形成生物被膜的大腸埃希菌感染應(yīng)謹慎選用這些抗菌藥物。

應(yīng)用能穿透生物被膜或抑制生物被膜形成的抗菌藥物治療產(chǎn)生物被膜菌株的感染至關(guān)重要。因此在未得到藥敏學結(jié)果之前，采用經(jīng)驗性抗菌藥物治療時，對此類患者應(yīng)優(yōu)先考慮對產(chǎn)生物被膜細菌有效的抗菌藥物，以提高控制感染的效果。

參考文獻：

［1］Veerachamy S，Yarlagadda T，Manivasagam G，et al．Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants：a review ［J］．Proc Inst Mech Eng H，2014，228（10）：1083-1099．

［2］Patel R．Biofilms and antimicrobial resistance［J］．Clin Orthop Relat Res，2005（437）：41-47．

［3］牛素平，陳煒，趙磊，等．危重癥患者尿路感染大腸埃希菌的耐藥性分析［J］．中華醫(yī)院感染學雜志，2015，25（2）：315-317．

［4］Ingle DJ，Clermont O，Skurnik D，et al．Biofilm Formation by and Thermal Niche and Virulence Characteristics of Escherichia spp ［J］．Appl Environ Microbiol，2011，77（8）：2695-2700．

［5］Cremet L，Corvec S，Batard E，et al．Comparison of three methods to study biofilm formation by clinical strains of Escherichia coli ［J］．Diagn Microbiol Infect Dis，2013，75（3）：252-255．

［6］Moskowitz SM，F(xiàn)oster JM，Emerson J，et al．Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis［J］．J Clin Microbiol，2004，42 （5）：1915-1922．

［7］劉曉峰，遲秀文，黃震，等．大腸埃希菌臨床菌株生物被膜形成的分析［J］．中華醫(yī)院感染學雜志，2011，21（9）：1732-1734．

［8］余虹，邱昕光，胡玉冰．大腸埃希菌感染及耐藥性分析［J］．中國當代醫(yī)藥，2011，18（2）：68-69．

［9］康運凱，閆燦．綜合性醫(yī)院2012年大腸埃希菌的臨床分布及耐藥性［J］．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學，2014，41（6）：1089-1090．

［10］Leung CY，Chan YC，Samaranayake LP，et al．Biocide resistance of Candida and Escherichia coli biofilms is associated with higher antioxidative capacities［J］．J Hosp Infect，2012，81（2）：79-86．

［11］Chen C，Liao X，Jiang H，et al．Characteristics of Escherichia coli biofilm production，genetic typing，drug resistance pattern and gene expression under aminoglycoside pressures［J］．Environ Toxicol Pharmacol，2010，30（1）：5-10．

［12］Hoiby N，Bjarnsholt T，Givskov M，et al．Antibiotic resistance of bacterial biofilms［J］．Int J Antimicrob Agents，2010，35（4）：322-332．

［13］朱斌．生物膜，細菌感染控制面臨的新挑戰(zhàn)［J］．中國感染控制雜志，2004，3（2）：185-188．

［14］Peeters E，Nelis HJ，Coenye T．Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates ［J］．J Microbiol Methods，2008，72（2）：157-165．

［15］Costerton W，Veeh R，Shirtliff M，et al．The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections［J］．J Clin Invest，2003，112（10）：1466-1477．

收稿日期：（2015-09-01）

中圖分類號：R978．1

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X（2016）02-0062-02

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．026