瑞舒伐他汀對(duì)高脂血癥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機(jī)制

謝地成，孫金華，李維正，李海玲，劉同祥（濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊6000；濰坊市人民醫(yī)院）

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瑞舒伐他汀對(duì)高脂血癥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機(jī)制

謝地成1，孫金華2，李維正1，李海玲2，劉同祥2
（1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261000；2濰坊市人民醫(yī)院）

摘要：目的 觀察長期瑞舒伐他汀灌胃對(duì)高脂模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬顯微結(jié)構(gòu)的影響。方法 將85只學(xué)習(xí)記憶能力正常的SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組20只、模型組65只，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)，制作高脂血癥模型。造模成功后隨機(jī)分為模型對(duì)照組、高劑量組、常規(guī)劑量組，每組20只，分別經(jīng)胃管給予生理鹽水、瑞舒伐他汀4 mg／kg、瑞舒伐他汀0．5 mg／kg，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水，1次／d，連續(xù)5個(gè)月。觀察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，HE染色觀察各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)的變化，Western blot方法檢測(cè)海馬Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型對(duì)照組逃避潛伏期明顯延長，跨越次數(shù)明顯減少；海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺失、凋亡，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整；海馬組織中Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達(dá)增加（P均＜0．05）。高劑量組和常規(guī)劑量組逃避潛伏期較模型對(duì)照組縮短，跨越次數(shù)增加；海馬錐體細(xì)胞層增厚，海馬神經(jīng)元排列整齊、緊密；海馬組織中Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達(dá)降低（P均＜0．05），與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0．05）。結(jié)論 長期瑞舒伐他汀灌胃可提高高脂血癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與降低海馬Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達(dá)，從而減少海馬神經(jīng)元凋亡、保護(hù)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：瑞舒伐他??；高脂血癥；學(xué)習(xí)記憶能力；海馬；Aβ1-42蛋白；Tau蛋白；大鼠

研究顯示，高脂血癥患者因血脂升高，易出現(xiàn)腦動(dòng)脈粥樣硬化、腦血管意外等疾病，加重腦細(xì)胞損傷。腦內(nèi)Aβ1-42含量增加和Tau蛋白過度磷酸化，在學(xué)習(xí)記憶能力損傷過程中起關(guān)鍵作用。他汀類藥物可顯著降低冠心病患者心血管事件的發(fā)生率和病死率［1～3］，是目前應(yīng)用最廣泛的降脂藥物。美國食品藥品監(jiān)督管理局不良反應(yīng)自發(fā)呈報(bào)系統(tǒng)報(bào)道，他汀類藥物可能會(huì)導(dǎo)致高脂血癥患者認(rèn)知能力降低，其機(jī)制可能與體內(nèi)膽固醇濃度過度降低有關(guān)，膽固醇濃度過低可影響神經(jīng)細(xì)胞代謝，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞損傷。2014年11月～2015年4月，我們對(duì)高脂血癥模型大鼠給予他汀類藥物干預(yù)，觀察其學(xué)習(xí)記憶能力及海馬顯微結(jié)構(gòu)的改變，并探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1．1材料 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠90只，月齡2個(gè)月，體質(zhì)量200～250 g，由濟(jì)寧魯抗醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。入組前行水迷宮檢測(cè)，選取認(rèn)知能力正常的大鼠85只用于實(shí)驗(yàn)。瑞舒伐他汀購于阿斯利康制藥有限公司。高脂飼料由1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉和79%基礎(chǔ)飼料組成［7］。

1．2動(dòng)物分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組20只和模型組65只，分別給予普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)45 d。第45天將模型組大鼠麻醉，經(jīng)心臟取血測(cè)定TG、TC，以TG＞1．35 mmol／L、TC＞1．54 mmol／L為造模成功。將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、常規(guī)劑量組和高劑量組各20只，分別經(jīng)胃管給予生理鹽水、瑞舒伐他汀0．5 mg／kg、瑞舒伐他汀4 mg／kg，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水，1次／d，連續(xù)5個(gè)月。

1．3學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè) 末次給藥后進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)。將大鼠置于水迷宮4個(gè)象限行適應(yīng)性訓(xùn)練半天后，分別在4個(gè)象限進(jìn)行定位航行試驗(yàn)，測(cè)定大鼠2 min內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。定位航行試驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，行空間探索試驗(yàn)，選擇相同入水點(diǎn)將大鼠分別放入水中，計(jì)數(shù)2 min內(nèi)大鼠跨越原平臺(tái)象限的次數(shù)，連續(xù)檢測(cè)3 d取平均值。

1．4大鼠海馬結(jié)構(gòu)觀察 采用HE染色。每組取10只大鼠用水合氯醛麻醉，經(jīng)心臟灌注甲醛固定，取大腦組織用甲醛固定，逐級(jí)脫水、透明、浸蠟、包埋，切4 μm厚切片。脫蠟、逐級(jí)入水后，蘇木素染色2 min，加入鹽酸乙醇分化液分化數(shù)秒后，顯微鏡觀察細(xì)胞核的染色程度。氨水返藍(lán)，伊紅染色2 min，自來水沖洗3 min，逐級(jí)脫水、透明，中性樹膠封閉，蓋玻片覆蓋，顯微鏡下觀察。

1．5大鼠海馬組織Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白檢測(cè)采用Western blot方法。每組取10只大鼠脫椎處死，立即取出大腦；低溫分離海馬組織，充分勻漿、裂解，離心取上清，分裝于0．5 mL離心管中，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取50 μL蛋白，加入6倍蛋白上樣緩沖液，加熱至煮沸。SDS-PAGE電泳，觀察目的蛋白凝膠條帶。80 V轉(zhuǎn)膜120 min，脫脂奶粉封閉1 h，依次加入一抗、二抗，TBST沖洗，ECL顯色，曝光顯影。應(yīng)用KODAK1D軟件對(duì)各個(gè)條帶進(jìn)行灰度值分析處理。用目的條帶與β-actin條帶的比值表示目的蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

2　結(jié)果

2．1各組水迷宮測(cè)驗(yàn)結(jié)果 見表1。

表1　各組水迷宮測(cè)驗(yàn)逃避潛伏期、跨越次數(shù)比較（珔x±s）

2．2各組海馬結(jié)構(gòu)比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠海馬錐體細(xì)胞層變薄，細(xì)胞間隙增大，排列紊亂、疏松，有神經(jīng)元細(xì)胞缺失、凋亡，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整。高劑量組和常規(guī)劑量組海馬錐體細(xì)胞層增厚，神經(jīng)元無明顯萎縮、核固縮、凋亡，與正常對(duì)照組比較亦未見明顯差異。

2．3各組海馬組織Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2　各組海馬組織中Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達(dá)灰度值比較（珔x±s）

3　討論

海馬是與學(xué)習(xí)、記憶、行為和情緒密切相關(guān)的重要腦功能區(qū)，也是應(yīng)激損傷和缺血損傷的主要靶器官。海馬神經(jīng)元損傷是誘發(fā)認(rèn)知能力和學(xué)習(xí)記憶能力下降的器質(zhì)性基礎(chǔ)之一［8］。研究顯示，海馬組織Aβ1-42和Tau蛋白含量增加與認(rèn)知能力降低呈正相關(guān)［6］。Aβ1-42激活膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)、氧化應(yīng)激產(chǎn)生自由基、胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，并誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重認(rèn)知能力的降低［5］。Tau蛋白參與神經(jīng)元軸突微管聚合、穩(wěn)定和組裝，其主要功能是維持已形成微管的穩(wěn)定性，并在微管延長過程中起到關(guān)鍵作用。研究表明，Tau蛋白過度磷酸化程度與認(rèn)知損傷程度呈正相關(guān)。Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白引起神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，從而導(dǎo)致認(rèn)知能力降低，腦內(nèi)Aβ1-42含量增加和Tau蛋白過度磷酸化在導(dǎo)致大鼠認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力降低過程中起關(guān)鍵作用，Aβ1-42可能通過CSK-3β誘導(dǎo)Tau蛋白過度磷酸化［9］，降低Tau蛋白結(jié)合微管的能力，Tau蛋白在神經(jīng)元內(nèi)聚積導(dǎo)致神經(jīng)元軸突轉(zhuǎn)運(yùn)障礙、乙酰膽堿釋放減少、蛋白酶體活性抑制、抗蛋白水解酶能力增強(qiáng)而具有神經(jīng)毒性，這些功能和結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致神經(jīng)元呈慢性進(jìn)行性變性［10，11］。在腦神經(jīng)細(xì)胞丟失并出現(xiàn)記憶和認(rèn)知功能降低之前，已出現(xiàn)由Tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)，是老年癡呆發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［12］。研究顯示，老年癡呆患者的Willis環(huán)和腦表面小血管的狹窄程度以及粥樣硬化斑塊較非癡呆人群更加顯著，腦小動(dòng)脈硬化直接導(dǎo)致大腦能量和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，引起神經(jīng)元細(xì)胞損傷，腦內(nèi)的局部炎癥反應(yīng)加重神經(jīng)元損傷［13］。

瑞舒伐他汀的藥理作用是抑制甲羥戊酸的合成，從而抑制Apo E分泌，降低中樞細(xì)胞外的Apo E水平，進(jìn)而阻止神經(jīng)纖維纏結(jié)［14］。趙水平等［15］報(bào)道，瑞舒伐他汀可通過減輕腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，從而提高大鼠認(rèn)知能力［15］。本研究顯示，與正常對(duì)照組比較，高脂血癥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，其原因可能與長期高血脂、腦動(dòng)脈粥樣硬化、腦血管意外加重腦細(xì)胞損傷等因素有關(guān)。長期使用瑞舒伐他汀可增加高脂血癥大鼠海馬錐體細(xì)胞層厚度，減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷，增加新生神經(jīng)細(xì)胞再生，減少大鼠海馬組織內(nèi)的海馬Aβ1-42和磷酸化Tau蛋表達(dá)，縮短水迷宮測(cè)驗(yàn)逃避潛伏期、增加跨越次數(shù)。高劑量組與常規(guī)劑量組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與瑞舒伐他汀降血脂功能強(qiáng)大且安全有效，常規(guī)劑量和高劑量均能很好降低血脂濃度有關(guān)。

綜上所述，長期使用瑞舒伐他汀可提高高脂血癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與降低海馬Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達(dá)，從而減少海馬神經(jīng)元凋亡、保護(hù)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)。

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·作者·編者·讀者·

收稿日期：（2015-09-22）

通信作者：劉同祥（E-mail：Liutxi＠126．com）

中圖分類號(hào)：R972

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X（2016）02-0028-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．010