卵巢上皮癌組織中CRM1、P-p27ser10表達(dá)及其對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響

高菲菲，薛愷，王酉（上海市第八人民醫(yī)院，上海005；復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院）

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卵巢上皮癌組織中CRM1、P-p27ser10表達(dá)及其對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響

高菲菲1，薛愷2，王酉3
（1上海市第八人民醫(yī)院，上海200235；2復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；3上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院）

摘要：目的 觀察卵巢上皮癌（EOC）組織中出核因子1（CRM1）和10號(hào)位絲氨酸（S10）磷酸化p27（P-p27ser10）的表達(dá)，并探討二者對(duì)EOC細(xì)胞株SKOV3增殖的影響。方法 取64例手術(shù)切除的EOC組織，采用免疫組化法檢測(cè)P-p27ser10、CRM1蛋白表達(dá)，分析二者與臨床病理特征的關(guān)系。以p27野生型［p27（WT）］為模板，構(gòu)建S10突變的p27去磷酸化突變細(xì)胞［p27（S10A）組］和擬磷酸化突變細(xì)胞［p27（S10D）組］，分別轉(zhuǎn)染S10磷酸化通路相關(guān)分子CRM1 siRNA和siRNA陰性質(zhì)粒到p27（S10D）細(xì)胞，建立S10D＋siCRM1組和S10D＋sictrl組，CCK-8法檢測(cè)p27 （WT）、p27（S10A）、陰性對(duì)照、S10D＋siCRM1和S10D＋sictrl組細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞周期。結(jié)果 P-p27ser10和CRM1在卵巢癌組織中的高表達(dá)率分別為76．6%、64．1%，其表達(dá)升高與卵巢癌的組織學(xué)分級(jí)、病理分期有關(guān)（P均＜0．05），二者表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0．656，P＜0．01）。S10D＋sictrl組較S10A組G1／S期細(xì)胞比例明顯減少，S10D＋siCRM1組較S10D＋sictrl組G1／S期細(xì)胞比例明顯增多（P均＜0．05）。S10D＋sictrl組細(xì)胞增殖較S10A組加快，S10D＋siCRM1組較S10D＋sictrl組減慢（P均＜0．05）。結(jié)論 EOC組織中CRM1和P-p27ser10表達(dá)升高；CRM1參與了p27 S10磷酸化的出核降解過(guò)程，抑制p27 S10磷酸化及CRM1表達(dá)均可引起細(xì)胞周期阻滯，降低EOC細(xì)胞的增殖能力。

關(guān)鍵詞：卵巢腫瘤；p27蛋白；10號(hào)位絲氨酸；磷酸化；出核因子1；細(xì)胞增殖

腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增生與腫瘤細(xì)胞增殖周期調(diào)控因子紊亂有關(guān)。p27蛋白是一種細(xì)胞周期激酶（CDK）抑制劑，可負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期，使細(xì)胞周期停滯在G1期［1］。p27主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮抑癌基因作用，其亞細(xì)胞定位在很大程度上影響生物學(xué)功能［2］。出核因子1（CRM1）是p27重要的出核蛋白，可以介導(dǎo)10號(hào)位絲氨酸（S10）磷酸化后的p27出核轉(zhuǎn)運(yùn)，該通路可能與腫瘤的異常增殖及周期調(diào)控紊亂密切相關(guān)［3～5］。2011～2014年，我們觀察了S10磷酸化p27（P-p27ser10）、CRM1在卵巢上皮癌（EOC）中的表達(dá)及與EOC細(xì)胞增殖的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1．1材料 收集2004～2009年在南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫婦幼保健院手術(shù)切除的EOC標(biāo)本64例，患者年齡30～74歲。排除其他惡性腫瘤，術(shù)前均未行放化療。均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診，根據(jù)2000年FIGO公布的手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)［5］，Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期36例。EOC細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，用RPMI1640完全培養(yǎng)基于5%CO2、飽和濕度、37℃常規(guī)培養(yǎng)傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1．2EOC組織中CRM1、P-p27ser10蛋白表達(dá)檢測(cè)取手術(shù)切除的EOC組織，4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)，使用免疫組化試劑盒檢測(cè)CRM1、P-p27ser10蛋白表達(dá)。顯微鏡下觀察染色情況，每5個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。CRM1陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為低表達(dá)，＞10%為高表達(dá)［7］；P-p27ser10陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為低表達(dá)，＞5%為高表達(dá)［8］。

1．3抑制p27 S10磷酸化與CRM1表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞周期和增殖的影響觀察1．3．1 質(zhì)粒構(gòu)建與siRNA轉(zhuǎn)染 擴(kuò)增人類(lèi)p27 cDNA全長(zhǎng)序列，將其重組于pcDNA3．1及pEGFPN1載體，構(gòu)建野生型p27-EGFP融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。以野生型p27基因真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP／N1-p27（WT）為模板，采用重疊延伸特異位點(diǎn)誘變法構(gòu)建EGFP標(biāo)記的突變型p27基因表達(dá)載體，一為pEGFP／N1-p27（S10A）（絲氨酸突變?yōu)楸彼?，不能發(fā)生磷酸化），二為pEGFP／N1-p27（S10D）（絲氨酸突變?yōu)樘於彼幔瑸閿M磷酸化突變體）。用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染p27（WT）、p27（S10A）、p27 （S10D）質(zhì)粒進(jìn)入SKOV3。48 h后，在含G418 500 μg／mL的培養(yǎng)基中進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)p27（WT）、p27（S10A）、p27（S10D）細(xì)胞。擴(kuò)增引物：p27（S10A）上游引物S10A＿F為5′-TAGGTGCCCCGTTAGACACTCG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為35 bp；下游引物S10A＿R為5′-CGAGTGTCTAACGGGGCACCTA-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為579 bp；p27（S10D）：上游引物S10D＿F為5′-TAGGGTCCCCGTTAGACACTCG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為35 bp；下游引物S10D＿R為5′-CGAGTGTCTAACGGGGACCCTA-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為579 bp。CRM1 siRNA序列：正義GGCUGCUGAACUCUAUAGA、反義UCUAUAGAGUUCAGCAGCC。分別轉(zhuǎn)染CRM1 siRNA和siRNA對(duì)照質(zhì)粒到p27（S10D）細(xì)胞，建立S10D＋siCRM1組和S10D＋sictrl組，用空載體作為陰性對(duì)照。24 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．3．2細(xì)胞周期檢測(cè) 取細(xì)胞用70%乙醇－20℃固定24 h，冷PBS洗滌；50 μg／mL碘化丙啶（PI）和250 μg／mL核糖核酸酶孵育30 min，過(guò)濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1．3．3細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法。取各組細(xì)胞，按2×104／mL接種于96孔板；待細(xì)胞完全貼壁后，更換為預(yù)先配置好的含10%CCK-8試劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃孵育1～2 h；用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度OD值，OD值越大，表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1CRM1、P-p27ser10蛋白表達(dá)及其與EOC臨床病理特征的關(guān)系 CRM1和P-p27ser10蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，在胞質(zhì)中有少量表達(dá)。CRM1蛋白高表達(dá)49例（76．6%），低表達(dá)15例（23．4%）；P-p27ser10蛋白高表達(dá)41例（64．1%），低表達(dá)23例（35．9%）。CRM1及P-p27ser10蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1。CRM1高表達(dá)與腫瘤FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，P-p27ser10高表達(dá)與腫瘤FIGO分期及組織學(xué)分級(jí)有關(guān)（P均＜0．05）。

表1　CRM1和P-p27ser10蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（例）

2．2CRM1與P-p27ser10表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析表明，CRM1與P-p27ser10的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0．656，P＜0．01）。

2．3抑制p27 S10磷酸化與CRM1表達(dá)SKOV3細(xì)胞周期和增殖的影響

2．3．1各組G1期和S期細(xì)胞所占比例比較 見(jiàn)表2。

表2　各組G1期和S期細(xì)胞所占比例比較（%）

2．3．2各組細(xì)胞增殖情況比較 p27（WT）、p27 （S10A）、陰性對(duì)照、S10D＋siCRM1、S10D＋sictrl組培養(yǎng)72 h的OD值分別為0．75±0．15、0．70± 0．10、1．23±0．16、1．32±0．08、1．80±0．21，S10D＋sictrl組較其他四組增殖明顯加快（P均＜0．05），S10D＋siCRM1組較S10D＋sictrl組增殖明顯減慢（P＜0．05），p27（WT）和p27（S10A）組較陰性對(duì)照組增殖加快（P均＜0．05）；陰性對(duì)照與S10D＋si-CRM1組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　討論

研究表明，大部分腫瘤的發(fā)生是由于癌基因和抑癌基因調(diào)控的細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)的通路改變所造成的。細(xì)胞周期抑制因子p27具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、凋亡及分化等多種生物學(xué)功能，p27相關(guān)調(diào)控機(jī)制異常與許多細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)［6，7］。作為細(xì)胞周期的“制動(dòng)”因素，細(xì)胞核內(nèi)p27蛋白的降解速度直接決定其絕對(duì)數(shù)量［8］。p27翻譯后蛋白的調(diào)控主要通過(guò)蛋白修飾（如磷酸化）來(lái)進(jìn)行［9］，這種翻譯后蛋白修飾決定了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位。目前已發(fā)現(xiàn)至少三條不同的途徑參與p27蛋白的降解，其中最主要的是p27 S10磷酸化位點(diǎn)依賴(lài)的p27磷酸化出核－泛素／蛋白酶體途徑［10，11］，S10磷酸化對(duì)于p27和CRM1之間的連接是必不可少的［12］。

研究顯示，CRM1參與介導(dǎo)蛋白質(zhì)和信使RNA的核轉(zhuǎn)運(yùn)，是一種重要的亞細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。很多穿梭于核膜的腫瘤相關(guān)蛋白，如腫瘤抑制蛋白和致癌蛋白，均需要CRM1作為核轉(zhuǎn)運(yùn)分子。研究發(fā)現(xiàn)，CRM1與p27的出核轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)［13］，CRM1可以識(shí)別磷酸化的p27，從而介導(dǎo)p27的出核降解。CRM1表達(dá)升高可促進(jìn)p27降解，提示CRM1可能通過(guò)促進(jìn)p27的凋亡來(lái)控制p27的活性［14，15］。

本研究顯示，CRM1和P-p27ser10在EOC組織中呈高表達(dá)，CRM1高表達(dá)與腫瘤FIGO分期、腫瘤分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，P-p27ser10高表達(dá)與腫瘤FIGO分期及組織學(xué)分級(jí)有關(guān)。相關(guān)性分析顯示，P-p27ser10與CRM1在EOC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。研究顯示，P-p27ser10與CRM1是p27出核轉(zhuǎn)運(yùn)通路上的關(guān)鍵分子，它們與p27的生物學(xué)功能密切相關(guān)。本研究構(gòu)建了p27（WT）、p27（S10A）、p27（S10D）細(xì)胞，用空載體作為陰性對(duì)照組，觀察各組細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖情況。由于只有p27（S10D）擬磷酸化細(xì)胞才能發(fā)揮類(lèi)似p27磷酸化的過(guò)程，因此我們分別轉(zhuǎn)染CRM1 siRNA和siRNA陰性質(zhì)粒到p27 （S10D）細(xì)胞，結(jié)果顯示，與p27擬磷酸化組（S10D ＋sictrl組）比較，p27（S10A）組增殖減慢。沉默CRM1的表達(dá)后，p27（S10D）組的細(xì)胞周期進(jìn)程明顯減慢，S10D＋siCRM1組較S10D＋sictrl組細(xì)胞增殖明顯減慢。表明抑制p27 S10磷酸化和抑制CRM1表達(dá)可引起SKOV3細(xì)胞周期阻滯，降低癌細(xì)胞的增殖能力。CRM1可通過(guò)抑制p27 S10磷酸化來(lái)影響SKOV3的細(xì)胞周期進(jìn)程及增殖。

綜上所述，CRM1相關(guān)的p27 S10磷酸化通路可能是導(dǎo)致EOC細(xì)胞內(nèi)p27出核降解的重要機(jī)制之一，p27 S10的異常磷酸化和CRM1的表達(dá)變化都可能引起細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，最終可能導(dǎo)致癌細(xì)胞的惡性增殖及EOC的惡性進(jìn)展。

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Expression of CRM1 and P-p27ser10in epithelial ovarian cancer tissues and their influence on proliferation of cancer cells

GAO Feifei1，XUE Kai，WANG You
（1 Shanghai Eighth People Hospital，Shanghai 200235，China）

Abstract：Objective To observe the expression of chromosome region maintenance 1（CRM1）and P-p27ser10in epithelial ovarian cancer（EOC）tissues，and to discuss their influence on the proliferation of EOC SKOV3 cell line．Methods We analyzed the association between the expression of CRM1 and P-p27ser10and clinical-pathological characteristics by using immunohistochemical method in 64 EOC samples．Using p27 wild type［p27（WT）］as the template，we established the p27 dephosphorylated mutants with S10 mutation［p27（S10A）group］and with mimic phosphorylated mutation［p27 （S10D）group］．In the p27（S10D）group，SKOV3 were respectively transfected by CRM1-targeted siRNA（S10D＋si-CRM1 group）and siRNA negative plasmid（S10D＋sictrl group）．CCK-8 and flow cytometry were respectively used to detect the proliferation and cell cycle in the p27（WT）group，p27（S10A）group，negative control group，S10D＋siCRM1 group and S10D＋sictrl group．Results In 64 EOC samples，the high expression rates of P-p27ser10and CRM1 were respectively 76．6%and 64．1%，whose high expression rates were associated with histological grade and clinical stage（all P ＜0．05），and they were positively correlated with each other（r＝0．656，P＜0．01）．As for cells in the G1／S phase，the percentage of cells in the S10D＋sictrl group was significantly lower than that of the p27（S10A）group and the percentage of cells in the S10D＋siCRM1 group was significantly higher than that of the S10D＋sictrl group（all P＜0．05）．CCK-8 showed that cell proliferation was significantly faster in the S10D＋sictrl group than in the p27 S10A group while the cellbook=2,ebook=7proliferation was significantly slower in the S10D＋siCRM1 group than in the S10D＋sictrl group（all P＜0．05）．Conclusions The expression of CRM1 and P-p27ser10was increased in EOC．CRM1 participated in the process of p27 S10 phosphorylated nuclear export degradation．The inhibition of both p27 S10 phosphorylation and CRM1 expression leaded to cell cycle arrest and decreased cell proliferation in EOC．

Key words：ovarian neoplasms；p27 protein；ser10；phosphorylation；chromosome region maintenance 1；cell proliferation

收稿日期：（2015-01-28）

通信作者簡(jiǎn)介：王酉（1982-），女，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤的基礎(chǔ)及臨床治療。E-mail：hanghangwang＠hotmail．com

作者簡(jiǎn)介：第一高菲菲（1981-），女，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤的臨床治療。E-mail：ffhigh＠sina．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81001160；81400161）。

中圖分類(lèi)號(hào)：R737．3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X（2016）02-0001-04

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．001