葡萄酒乳酸菌發(fā)酵劑研究進(jìn)展

李瑩瑩，劉　葉

（甘肅紫軒酒業(yè)有限公司，甘肅嘉峪關(guān)735100）

葡萄酒乳酸菌發(fā)酵劑研究進(jìn)展

李瑩瑩，劉葉

（甘肅紫軒酒業(yè)有限公司，甘肅嘉峪關(guān)735100）

蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）是葡萄酒釀造中重要的二次發(fā)酵，由乳酸菌（LAB）進(jìn)行。自發(fā)進(jìn)行的MLF難以控制，越來越多的葡萄酒生產(chǎn)商都選擇使用商業(yè)化蘋果酸-乳酸細(xì)菌（MLB）發(fā)酵劑進(jìn)行MLF，因此對MLB發(fā)酵劑進(jìn)行研究具有重要的現(xiàn)實意義。介紹了商業(yè)MLB發(fā)酵劑的發(fā)展概況、種類以及直投式MLB發(fā)酵劑。通過對目前研究重點的闡述，指出了MLB發(fā)酵劑未來研究的發(fā)展方向與創(chuàng)新點。

葡萄酒；MLF；MLB發(fā)酵劑

釀酒是葡萄汁到葡萄酒的生物轉(zhuǎn)化過程，釀酒酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵（AF），將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化為酒精和CO2。除了進(jìn)行酒精發(fā)酵，有些葡萄酒還要進(jìn)行二次發(fā)酵，也就是蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）[1]。MLF是葡萄酒進(jìn)行生物降酸的有效手段，可以提高葡萄酒的穩(wěn)定性，改善葡萄酒的質(zhì)量[2]。通常情況下，MLF是由存在于葡萄皮與酒窖中的微生物進(jìn)行的，發(fā)酵時間難以預(yù)計，而且結(jié)果往往不能使人滿意[3]。接種商業(yè)蘋果酸-乳酸細(xì)菌（MLB）發(fā)酵劑逐漸成為一種趨勢，因為這不僅可以順利完成MLF，還可以減少自發(fā)發(fā)酵引起的風(fēng)險[4]。對微生物來說，葡萄酒是非常惡劣的環(huán)境，因此即使使用了商業(yè)發(fā)酵劑也并不能保證順利完成發(fā)酵[5]。細(xì)菌的生長會被很多因素影響，主要是葡萄酒的理化性質(zhì)和其他微生物的存在。大多數(shù)商業(yè)MLB發(fā)酵劑只含有酒酒球菌，接種這些含有單菌株的發(fā)酵劑可以促進(jìn)葡萄酒快速地啟動和完成MLF，并且有助于良好風(fēng)味的形成。

關(guān)于MLB發(fā)酵劑，國外研究較早，且已取得了很大的成就。很多性狀優(yōu)良的MLB經(jīng)過分離、篩選、冷凍干燥，已經(jīng)制成商業(yè)活性MLB，在葡萄酒生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。而我國對MLB的分離篩選工作進(jìn)行的很少，還未能將國內(nèi)豐富的MLB資源真正開發(fā)利用起來。目前，我國多數(shù)葡萄酒廠依靠進(jìn)口活性干乳酸菌或自然發(fā)酵進(jìn)行MLF，從而使生產(chǎn)成本極大增加。所以，充分利用國內(nèi)資源，篩選適合葡萄酒生產(chǎn)的LAB菌種已成為我國研究人員亟須完成的課題。

1　葡萄酒MLB發(fā)酵劑概況

1.1發(fā)展歷史

1980年，冷凍干燥MLB發(fā)酵劑出現(xiàn)，在此之前液體MLB發(fā)酵劑使用了幾十年，冷凍干燥MLB發(fā)酵劑的使用實現(xiàn)了對葡萄酒MLF的控制和預(yù)測。1990年，產(chǎn)生了直投式MLB發(fā)酵劑。實際生產(chǎn)中，葡萄酒商多用直投式MLB發(fā)酵劑進(jìn)行MLF[6]，因為它不僅滿足了生產(chǎn)者的需求，而且提高了葡萄酒的品質(zhì)，使用起來也更加方便。目前，市面上有各種各樣的MLB發(fā)酵劑，大多以凍干的形式銷售，也有一些是液體形式。

1.2包含菌種

從1960年到1970年，菌株ML34是倡導(dǎo)“使用單一菌株誘導(dǎo)MLF”這一概念的標(biāo)準(zhǔn)菌株。大多數(shù)商業(yè)MLB發(fā)酵劑只含有酒酒球菌，最近的研究著重于將植物乳桿菌也應(yīng)用于商業(yè)發(fā)酵劑的生產(chǎn)中。有研究者從巴塔哥尼亞葡萄酒中分離出植物乳桿菌進(jìn)行MLF，結(jié)果表明，有2株具有作為巴塔哥尼亞葡萄酒MLB發(fā)酵劑的潛力[7]。

1.3菌株篩選標(biāo)準(zhǔn)

發(fā)酵劑中的MLB菌株篩選自自發(fā)進(jìn)行MLF的葡萄酒，它們在葡萄酒中都有很好的發(fā)酵特性。商業(yè)MLB發(fā)酵劑具有非常高的活菌數(shù)（約1011cfu/g），這樣才能確保在葡萄酒中具有足夠強(qiáng)的生存能力。要篩選出能夠在惡劣葡萄酒環(huán)境中生長的菌株，需要制定嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)。前期的研究人員已經(jīng)制定了嚴(yán)格的MLB發(fā)酵劑菌株的篩選標(biāo)準(zhǔn)[8]。主要包括下面幾方面：耐低pH值、高濃度乙醇和SO2，在葡萄酒中具有良好的生長特性，與釀酒酵母有良好的兼容性，在生產(chǎn)過程中存活率高，不產(chǎn)生生物胺，不產(chǎn)生不良風(fēng)味[9]，產(chǎn)生芳香成分，有利于葡萄酒風(fēng)味的構(gòu)成。

1.4國內(nèi)MLB發(fā)酵劑發(fā)展現(xiàn)狀

酒酒球菌SD-2a是西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院自行選育，并于2002年獲得國家專利的1株優(yōu)良酒酒球菌。有較強(qiáng)的耐酒精能力，嗜酸，生長于pH 3.5～3.8的葡萄汁和果酒中，10%vol乙醇不抑制其生長。對低pH值、較高濃度SO2也有較好抗性，具有較快的MLF速率和較強(qiáng)的降酸能力。用SD-2a進(jìn)行MLF的葡萄酒樣揮發(fā)酸升高值較低且穩(wěn)定。酒酒球菌SD-2a的精氨酸代謝特性良好，不會過多降解精氨酸、產(chǎn)生脲、瓜氨酸等前體物質(zhì)，而且不會導(dǎo)致致癌物質(zhì)氨基甲酸乙酯的過量合成[10]。用該菌種進(jìn)行MLF后的干紅葡萄酒口感柔和、潤口、協(xié)調(diào)，香氣濃郁，結(jié)構(gòu)平衡，酒質(zhì)明顯提高[11]。但是目前，我國MLB發(fā)酵劑的制備技術(shù)還不是很完善，細(xì)胞存活率低、保存時間短，特別是工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)還未開發(fā)出來。因此，國內(nèi)還沒有廠家生產(chǎn)商品化的MLB發(fā)酵劑。羅華對SD-2a進(jìn)行了高密度培養(yǎng)條件及凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化[12]。黃科建立SD-2a活性干粉生產(chǎn)HACCP體系，并對SD-2a干粉進(jìn)行品質(zhì)測定。張如金對SD-2a活性干粉的生產(chǎn)工藝參數(shù)及生產(chǎn)性能進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，這些研究為酒酒球菌SD-2a活性干粉的工業(yè)化生產(chǎn)和推廣奠定了基礎(chǔ)[13]。此外，劉凱研究了昌黎產(chǎn)區(qū)的越千年干紅葡萄酒中分離出的60株MLB。通過酒精和酸耐性試驗表明，酒酒球菌C10和J2可以在模擬葡萄酒環(huán)境中生長（pH3.0，乙醇14%vol）。這2株菌株的蘋果酸降解率分別是每天430.625mg/L和76.994mg/L。研究表明，酒酒球菌C10和J2具有作為MLB發(fā)酵劑的潛力[14]。

2　商業(yè)MLB發(fā)酵劑種類和使用方式

商業(yè)MLB發(fā)酵劑主要有3種不同的形式：液態(tài)（liquid）、冷凍態(tài)（frozen）以及凍干粉（lyophilised）。液體懸液的保質(zhì)期短，使用前需要3～7 d的準(zhǔn)備時間。需要用不含SO2的葡萄汁活化，葡萄汁的總糖水平要調(diào)節(jié)到180g/L。如果沒有葡萄汁，也可以用已經(jīng)完成MLF的葡萄酒（50%vol的總SO2小于10mg/L的葡萄酒、25%vol的水和25%vol的蘋果汁）活化，用碳酸鈣調(diào)整pH3.5～3.6，培養(yǎng)溫度在22～26℃。冷凍發(fā)酵劑也需要在室溫下用葡萄汁（3 L水，3 L葡萄汁和30g酵母提取物）活化。用碳酸鈣或其他緩沖液調(diào)整pH4.0，并充分混勻。加入170g已經(jīng)解凍的發(fā)酵劑，密封并充分混勻，18～24℃培養(yǎng)48 h后接種。凍干發(fā)酵劑需要在葡萄酒與水比例為1∶1的混合溶液中活化，培養(yǎng)3～14 d后再添加到葡萄酒中，要求活化所用的葡萄酒pH值大于3.3，總SO2小于30mg/L?；罨^程中，監(jiān)控蘋果酸下降，大約2/3蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸時，以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種到葡萄酒中。

3　直投式MLB發(fā)酵劑

直投式MLB發(fā)酵劑也是凍干發(fā)酵劑，但是使用更加方便，可以不經(jīng)活化直接加入到需要進(jìn)行MLF的葡萄酒中。直投式MLB發(fā)酵劑是目前葡萄酒發(fā)酵工業(yè)的一個研究熱點，其具有以下優(yōu)點：活菌數(shù)高(1010～1012cfu/g)、活力高、接種量少、保質(zhì)期長、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。直投式MLB發(fā)酵劑不需要經(jīng)過活化、擴(kuò)培等預(yù)處理而直接應(yīng)用于生產(chǎn)，大大提高勞動生產(chǎn)率與產(chǎn)品質(zhì)量[15]，同時減少發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)成本與生產(chǎn)周期。首次用于直投的葡萄酒MLB發(fā)酵劑生產(chǎn)于1993年，現(xiàn)在已經(jīng)在釀酒過程中廣泛應(yīng)用。商業(yè)直投發(fā)酵劑中的細(xì)菌在培養(yǎng)過程中經(jīng)過脅迫和馴化，在投入葡萄酒后可以更好地耐受惡劣環(huán)境。并不是所有的菌株都可以存活于馴化過程。事實上，分離到的MLB只有很少一部分可以被應(yīng)用于這個生產(chǎn)工藝。菌株有可能因為長勢弱、ML酶活性低、或者不能幸存于這個過程而被淘汰。最后存活的菌株都是健壯的、有能力完成MLF的、可以生產(chǎn)出高質(zhì)量葡萄酒的菌株。這些MLB發(fā)酵劑可以直接添加到葡萄酒中，某些在加入葡萄酒之前需要進(jìn)行短時間的簡單活化，這樣可以使細(xì)菌均勻分布在酒中。

4　未來MLB發(fā)酵劑發(fā)展趨勢

4.1新型MLB菌株的篩選

酒酒球菌是商業(yè)MLB發(fā)酵劑包含的主要菌種，乳桿菌和片球菌也可以進(jìn)行MLF，但不能發(fā)酵完全[16]。有17種不同的乳桿菌和釀酒有關(guān)，有些和葡萄有關(guān)，有些和葡萄酒AF以及MLF有關(guān)[17]。最近的實驗表明植物乳桿菌可以有效進(jìn)行MLF，并可以使紅葡萄酒產(chǎn)生令人滿意的香氣特征[18]。有害片球菌也可以進(jìn)行MLF，將商業(yè)酒酒球菌發(fā)酵劑接種到Caino白葡萄酒中進(jìn)行MLF，用HPLC定量蘋果酸和乳酸，結(jié)果表明，本地有害片球菌可以優(yōu)于商業(yè)酒酒球菌占主導(dǎo)地位，可以在Caino白葡萄酒中進(jìn)行MLF，并使酒體更加成熟[19]。此外，使用從本地區(qū)葡萄酒微生物區(qū)系中篩選的菌株來進(jìn)行MLF是很有利的，因為菌株對葡萄酒環(huán)境有著天然的適應(yīng)能力，同時也保證了區(qū)域葡萄酒的特點[20]。

4.2MLB菌株的改良

可以通過基因重組對MLB菌株進(jìn)行基因改良。一般是對目標(biāo)MLB外源基因的表達(dá)或基因超表達(dá)或有害基因的去除。這通常需要導(dǎo)入載體質(zhì)粒，但是酒酒球菌不像其他乳酸菌，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化很困難，極少成功[21-22]。另一種外源基因表達(dá)的方法是噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)，盡管噬菌體有可能導(dǎo)致MLF失敗，但對酒酒球菌來說這種方法理論上也是可行的，但是目前轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還不是很清楚，需要進(jìn)一步的研究。還有一種基因改良的方法是轉(zhuǎn)座子，問題是當(dāng)前的結(jié)合方法不能夠使酒酒球菌基因置換，因為轉(zhuǎn)移頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于重組頻率[23-24]。盡管基因去除或表達(dá)都是很有益的，但是把這些技術(shù)運(yùn)用到酒酒球菌很困難。因此對脅迫相關(guān)單個基因的鑒定是很重要的。例如MLF中抵抗脅迫的基因涉及到多位點的多基因，并且廣泛分布在基因組，使得目標(biāo)基因的操控高度復(fù)雜。影響MLF的主要脅迫因素之間不僅在物理水平相互作用，還潛在于基因水平。如果僅僅提升菌株抵抗某種脅迫的能力，有可能會使抵抗其他脅迫的能力受到不利影響。

通過非重組來改良菌株用于工業(yè)生產(chǎn)也是不錯的選擇，目前這種方法得到越來越多的重視。其中之一就是定向進(jìn)化（DE），也叫適應(yīng)進(jìn)化，已經(jīng)成功地運(yùn)用于乳桿菌[25-28]。定向進(jìn)化是對種群全基因組進(jìn)行操控并使多樣化，不需要對全基因組有深入的了解。DE的前提是微生物體在連續(xù)的脅迫環(huán)境下會逐漸適應(yīng)環(huán)境。有利于個體生長并繁殖的突變使菌株在脅迫環(huán)境下逐漸增長，這樣就能被篩選出來[29]。酒酒球菌是快速進(jìn)化的個體，而葡萄酒又具有很強(qiáng)的抑制作用，這使得定向進(jìn)化成為改良酒酒球菌菌株的很好的方法。但是，目前對酒酒球菌定向進(jìn)化的過程還沒有完全了解，因此需要進(jìn)一步的研究。

4.3不同的菌株用于生產(chǎn)不同的酒

根據(jù)不同的葡萄酒的類型和特點來選擇適合的菌株。多年來，MLF被認(rèn)為是簡單的L-蘋果酸脫羧為L-乳酸和CO2。Henick-K ling描述了MLB的代謝活性以及對葡萄酒香氣組分的影響[30]。Richardson報道了單個MLB菌株對葡萄酒具體香氣的貢獻(xiàn)。某些菌株產(chǎn)生特征性的黃油味、酵母味以及堅果香氣，而另一些菌株可以賦予葡萄酒果香并減少生青味。MLB發(fā)酵劑將會以其對葡萄酒整體香氣輪廓的感官貢獻(xiàn)為特征，特定的MLB發(fā)酵劑將會有助于生產(chǎn)具有特定香氣的葡萄酒。

4.4誘導(dǎo)MLF的新技術(shù)

近年來的研究提出利用一些新技術(shù)來誘導(dǎo)MLF，如固定化細(xì)胞或者酶技術(shù)[31]。使用高密度的固定化細(xì)胞來進(jìn)行MLF在一定程度上可以抵抗高乙醇和低pH對菌體的傷害，并且細(xì)胞可以循環(huán)利用。目前主要有2種固定化方法，細(xì)菌細(xì)胞的包裝[32-33]和附著/吸附在支撐物上[34-35]。

包埋入Lentikats?基質(zhì)中的酒酒球菌細(xì)胞在14%vol乙醇以及低酸條件下蘋果酸降解率都增加。對于用此方法固定細(xì)胞進(jìn)行MLF對葡萄酒組分和感官特性的整體影響，需要進(jìn)一步的研究來確定。大量的研究報道了使用游離或固定化的MLB進(jìn)行MLF，而使用游離或固定化M leA酶進(jìn)行直接的生物轉(zhuǎn)化幾乎不曾被研究。有可能是因為這個過程需要錳（Mn+）和NAD+作為輔酶因子[36]。和游離酶相比，固定化酶在適應(yīng)環(huán)境上更強(qiáng)和穩(wěn)定[37]。但M leA酶活性最優(yōu)的pH值是6.0，并且反應(yīng)體系需要NAD+，這都需要進(jìn)一步的研究來解決。

5　小結(jié)

為了使葡萄酒更好地進(jìn)行MLF，接種商業(yè)化MLB已經(jīng)成為一種趨勢。市面已經(jīng)有各種類型的MLF發(fā)酵劑在售，可以滿足不同類型葡萄酒的香氣和口感需求。另外，近些年隨著分子生物學(xué)和酶技術(shù)的快速發(fā)展，MLB菌種改良和一些誘導(dǎo)MLF的新技術(shù)也將變成可能。與此同時，我國也要積極開展本土優(yōu)良MLB菌種的篩選、凍干保護(hù)劑配方以及冷凍干燥工藝優(yōu)化的相關(guān)研究，從而生產(chǎn)出擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的MLB發(fā)酵劑，解決我國MLF發(fā)酵劑目前全部依賴進(jìn)口的問題。這既有利于提高我國葡萄酒產(chǎn)品的質(zhì)量，又有利于節(jié)約成本，提高了我國葡萄酒企業(yè)的國際競爭力。

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Research Progress in Lactic Acid Bacteria Fermenting Agent forgrapeW ine

LIYingying and LIU Ye
（ZixuanWinery Co.Ltd.,Jiayuguan,Gansu 735100,China）

Malic acid-lactic acid fermentation(MLF)is the important secondary fermentation performed by lactic acid bacteria in the production ofgrape w ine.Spontaneous MLF is hard to control.Accordingly,more and more w ineries use commercial MLB fermenting agent for MLF.The study of MLB fermenting agentwasof importantsignificance.In this paper,the developmentstatusof commercialMLB fermenting agents,their varieties,and direct-inputMLB fermenting agentswere introduced.The developmentdirections and the innovative points ofMLB fermenting agents in the futurewere discussed.

grapew ine;MLF;MLB fermenting agent

TS262.6；TS261.4

A

1001-9286(2016)11-0100-04

10.13746/j.njkj.2016234

2016-07-22

李瑩瑩(1990-)，女，碩士研究生。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.1021.007.htm l。