金胺“O”熒光染色LED顯微鏡檢測(cè)痰中抗酸桿菌的應(yīng)用

毛小芳，楊敏，謝英，魏云爍(﹑峽江縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江西峽江33409；﹑新余市婦幼保健院檢驗(yàn)科，江西新余338000)

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金胺“O”熒光染色LED顯微鏡檢測(cè)痰中抗酸桿菌的應(yīng)用

毛小芳1，楊敏2，謝英1，魏云爍1
(1﹑峽江縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江西峽江331409；2﹑新余市婦幼保健院檢驗(yàn)科，江西新余338000)

摘要：目的探討金胺“O”熒光染色LED顯微鏡法在檢測(cè)痰中抗酸桿菌的應(yīng)用。方法依據(jù)《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃﹑痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》對(duì)2106例痰標(biāo)本同時(shí)用萋-尼氏抗酸染色法和金胺“O”熒光染色法查找抗酸桿菌，比較兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析金胺“O”熒光染色LED顯微鏡檢測(cè)抗酸桿菌的靈敏度和特異性。結(jié)果2106例痰標(biāo)本中熒光染色陽(yáng)性315例，陽(yáng)性率15.0%；萋-尼氏染色陽(yáng)性283例，陽(yáng)性率13.4%，兩種方法符合率89.8%。對(duì)比兩組檢測(cè)結(jié)果，金胺“O”熒光染色LED顯微鏡法檢測(cè)的靈敏度和特異性均較高。結(jié)論金胺“O”熒光染色LED顯微鏡法是一種檢測(cè)靈敏度高﹑特異性好﹑操作簡(jiǎn)便﹑快速的方法，對(duì)結(jié)核病患者的早期診斷和治療具有重要意義。

關(guān)鍵詞：熒光染色；LED顯微鏡；抗酸染色；結(jié)核病

中國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，目前我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn)，占全球發(fā)病人數(shù)的14%，位居全球第二位[1]。臨床上對(duì)于結(jié)核病的診斷多使用X線﹑病理切片﹑痰涂片鏡檢﹑痰培養(yǎng)等，但X線對(duì)無(wú)典型影像學(xué)表現(xiàn)患者有局限性，病理切片耗時(shí)長(zhǎng)[2]。痰標(biāo)本直接涂片法操作簡(jiǎn)單﹑價(jià)格低廉，在我國(guó)廣泛用于肺結(jié)核病人的診斷。但傳統(tǒng)萋-尼氏抗酸染色法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，陽(yáng)性檢出率相對(duì)較低；金胺“O”熒光染色具有操作簡(jiǎn)便﹑結(jié)果判讀方便等優(yōu)點(diǎn)[3]。本次研究對(duì)2106例疑是結(jié)核病患者痰標(biāo)本采用金胺“O”熒光染色LED顯微鏡和萋-尼氏抗酸染色兩種方法同時(shí)檢測(cè)痰標(biāo)本中抗酸桿菌，進(jìn)行比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源2106例標(biāo)本來(lái)源于2013年10月至2015年3月江西省峽江縣疾控中心結(jié)核病防治門(mén)診就診的疑是肺結(jié)核患者，包括初診患者和復(fù)治﹑隨訪患者。

1.2主要試劑及器材（由全球基金結(jié)核病項(xiàng)目提供）結(jié)核病熒光法染色液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)414041，有效期20160407。萋-尼氏染色液本實(shí)驗(yàn)室按《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃﹑痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[4]規(guī)定方法配制。寧波舜宇EX30LED熒光顯微鏡。奧林巴斯BA200Inf生物顯微鏡。青島海爾HR40-A2生物安全柜。帆船牌清潔﹑無(wú)油脂一端磨砂面的新玻片。1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理每份標(biāo)本涂片2張，一張用于傳統(tǒng)萋-尼氏染色，一張用于金胺“O”熒光染色；挑取痰標(biāo)本中呈膿樣﹑干酪樣可疑部分均勻涂抹成約2cm×1cm的卵圓形痰膜，盡量使2張?zhí)灯娜√挡课哗p痰膜厚度﹑痰膜大小基本一致；將涂好的痰片室溫下干燥后于5s內(nèi)穿過(guò)酒精燈火焰上方4次將其固定。

1.3.2染色方法

1.3.2.1傳統(tǒng)萋-尼氏染色按《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃﹑痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》規(guī)定方法進(jìn)行初染﹑脫色﹑復(fù)染[4]。

1.3.2.2熒光染色初染：將已固定的玻片置于染色架上，滴加0.1%的金胺O染色液覆滿玻片，放置15~20min；脫色：用自來(lái)水緩緩沖去初染液，滴加脫色液，脫色2min或至無(wú)色；復(fù)染：用自來(lái)水緩緩沖去脫色液，滴加0.5%高錳酸鉀復(fù)染液覆滿玻片1min，用自來(lái)水緩緩沖去復(fù)染液，將玻片瀝干水分，晾干。

1.3.3顯微鏡鏡檢萋-尼氏染色涂片用生物顯微鏡，用100×油鏡進(jìn)行細(xì)致觀察，在藍(lán)色背景下抗酸桿菌呈紅色桿狀。熒光染色用LED熒光顯微鏡，40×物鏡觀察，在暗背景下抗酸桿菌發(fā)出黃綠色熒光，呈桿狀略彎曲。

1.3.4結(jié)果報(bào)告萋-尼氏染色鏡檢結(jié)果按《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃﹑痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告。熒光染色鏡檢結(jié)果報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)：熒光抗酸桿菌陰性：0條/100視野；熒光抗酸桿菌陽(yáng)性：1~9條/100視野；熒光抗酸桿菌陽(yáng)性（1+）：10~49條/50視野；熒光抗酸桿菌陽(yáng)性（2+）：1~9條/每視野；熒光抗酸桿菌陽(yáng)性（3+）：10~99條/每視野；熒光抗酸桿菌陽(yáng)性（4+）：>100條/每視野[4]。

2　結(jié)果

2013年10月至2015年3月本實(shí)驗(yàn)室共收集痰標(biāo)本2106例，傳統(tǒng)萋-尼氏染色法共檢出陽(yáng)性283例，陽(yáng)性率13.4%，其中<1+有36例，1+有160例，2+有45例，3+有23例，4+有19例；熒光染色法共檢出陽(yáng)性315例，陽(yáng)性率15.0%，其中<1+有55例，1+有173例，2+有45例，3+有23例，4+有19例。熒光染色法除與萋-尼氏法全部283例陽(yáng)性結(jié)果完全相符外，另有32例標(biāo)本萋-尼氏染色法檢測(cè)為陰性，熒光染色法檢測(cè)為陽(yáng)性，此32例標(biāo)本熒光染色法結(jié)果報(bào)告均為1+及<1+低含菌量標(biāo)本。此32例含菌量低標(biāo)本于檢測(cè)當(dāng)日用離心集菌法涂片，重新用萋-尼氏法染色鏡檢，均報(bào)告為陽(yáng)性，兩種方法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性總數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.00，P＞0.05），<1+兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.05，0.01

表1　熒光染色法與萋-尼氏染色法檢測(cè)結(jié)果比較

3　討論

從本資料中可見(jiàn)，痰標(biāo)本直接涂片查找抗酸桿菌時(shí)，熒光染色法的敏感度高于傳統(tǒng)萋-尼氏染色法。傳統(tǒng)萋-尼氏染色法是基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)涂陽(yáng)肺結(jié)核病人的主要手段，該法只對(duì)少量的痰液進(jìn)行檢查，只有當(dāng)細(xì)菌達(dá)到較高濃度（10000 個(gè)/ml）時(shí)才能觀察到[5]，很大程度上限制了這種方法的檢測(cè)靈敏度。而熒光染色法鏡檢是在暗背景下抗酸桿菌發(fā)出藍(lán)綠色熒光，呈桿狀略彎曲，痰細(xì)胞及雜質(zhì)不發(fā)光，萋-尼氏染色法鏡檢時(shí)在藍(lán)色痰細(xì)胞背景下找紅色桿狀菌，兩種方法相比較熒光染色法肉眼更容易發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌[6]。本次實(shí)驗(yàn)的2106例痰標(biāo)本中32例低含菌量標(biāo)本開(kāi)始用萋-尼氏染色法檢測(cè)時(shí)為陰性而用熒光染色法檢測(cè)時(shí)為陽(yáng)性，用離心集菌法重新對(duì)這32例痰標(biāo)本涂片﹑染色﹑鏡檢，報(bào)告結(jié)果均為陽(yáng)性。表明當(dāng)痰標(biāo)本含菌量較低時(shí)，熒光染色法鏡檢的敏感性?xún)?yōu)于傳統(tǒng)萋-尼氏染色法，而特異性無(wú)差異[7]。

熒光染色LED顯微鏡檢測(cè)法較傳統(tǒng)萋-尼氏染色法操作簡(jiǎn)便。傳統(tǒng)萋-尼氏染色法操作繁瑣，技術(shù)要求較高，初染加熱時(shí)易產(chǎn)生氣溶膠，油鏡觀察視野范圍小，對(duì)陰性結(jié)果的判讀需選取300視野，鏡檢時(shí)間長(zhǎng)，檢驗(yàn)人員易疲勞，易漏檢低含菌量涂片[8]。熒光染色LED顯微鏡檢測(cè)法初染時(shí)不需加熱，減少了生物安全隱患，鏡檢采用40×的高倍鏡觀察，觀察視野范圍大，對(duì)陰性結(jié)果的判讀僅需選取100視野，顯著加快了鏡檢速度，判讀和報(bào)告結(jié)果變得簡(jiǎn)單﹑快捷[9]。

綜上所述，金胺“O”熒光染色LED顯微鏡法檢測(cè)痰中的抗酸桿菌具有操作簡(jiǎn)便﹑快捷﹑準(zhǔn)確﹑可靠﹑靈敏度高，結(jié)果判讀方便等優(yōu)點(diǎn)[10]，與傳統(tǒng)萋-尼氏染色法相比，能夠顯著提高低含菌量標(biāo)本的檢出率，可在結(jié)核病患者的早期診斷和治療中推廣應(yīng)用。

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(收稿日期2015-05-25；修回日期2015-08-27)

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.030

中圖分類(lèi)號(hào)：R378.91，R446.19

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-1129(2016)01-0082-02