基因組測序技術及其臨床應用研究進展

梁振山綜述，曾令兵，萬臘根審校(1、南昌大學醫(yī)學院，江西南昌0006；2、江西省兒童醫(yī)院檢驗科，江西南昌0006；、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌0006)

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基因組測序技術及其臨床應用研究進展

梁振山1，2綜述，曾令兵3，萬臘根3審校
(1、南昌大學醫(yī)學院，江西南昌330006；2、江西省兒童醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；3、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006)

摘要：目前，隨著全基因組測序技術的進一步發(fā)展，基因組測序技術在臨床與科研中越來越發(fā)揮著重要作用。近幾年來，基因組測序技術迅速發(fā)展，其在愈來愈受到學者們的關注。本文旨在對基因組及、基因組測序技術及其在臨床診斷中的應用做一綜述。

關鍵詞：基因組；基因序列；基因測序技術

1　基因組及基因測序技術的進展

從分子生物學角度來講，雙鏈螺旋結構的DNA分子控制每個生物個體的遺傳特性?；蚪M在生物學中的定義，是指包含該生物體中所有的DNA（有些病毒是RNA）中的全部遺傳信息，也即是一個生物體中完整的染色體DNA序列。顧名思義，微生物的基因組，即是指微生物染色體中的所有DNA序列?；蚪M學，也即是研究基因組構成的一門學科，它興起于上世紀90年代初的人類基因組計劃。在人類基因組計劃實施的同時，人們也啟動了微生物的基因組研究計劃。1995年，Fleischmann研究小組率先發(fā)布了第一株微生物的全基因圖譜。他們采用全基因組隨機測序法（即wholegenome shotgun sequencing，簡稱“鳥槍測序法”），對流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）的全基因組進行了較為全面的分析，獲得了第一株微生物的全基因組數據，這在細菌基因組測序的歷史上屬首次[1]。此后，隨著測序技術的發(fā)展，越來越多的臨床微生物（或者稱為病原微生物）、模式微生物、環(huán)境微生物、工業(yè)微生物等都被測序，并獲得全基因組數據[2-7]。近年來，完成的基因組（包括微生物基因組在內）呈現幾何級數增長，這不僅為探索基因本質提供了大量的數據，也為后基因組時代的到來奠定了堅實的基礎。

2　基因組測序技術的研究進展

Sanger測序是最早的基因測序技術，被稱為第一代測序技術，它是由Fredrick Sanger在1975年發(fā)明的。該測序方法又稱為“雙脫氧鏈終止法”[8]。其基本原理是在聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）的過程中，不斷地在引物的3’端加入dNTP，使得模板得以延伸，最終得到新的模板。一旦在合成模板鏈的過程中摻和進的是雙脫氧核苷酸（ddNTP）。由于ddNTP的3’端缺少羥基，無法再繼續(xù)延伸，因此PCR反應至此位點終止。最終，PCR的產物將形成一系列由5’-3’ddNTP組成的、長短不一的DNA片段。采用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離這些DNA片段。并借助放射自顯影技術檢測這些DNA片段，就可以獲得相應的序列信息。除Sanger測序外，這個時期還出現了一系列其他的測序方法，如焦磷酸測序法（二代測序技術中被Roche公司所采用）、鏈接酶法等[9-11]。但是，他們的共同核心都是借助了Sanger的可中斷PCR反應的ddNTP作為底物。

Sanger測序法的優(yōu)勢是其測序讀長能夠達到1，000bp，并且測序的準確率高達99.999%。但是缺點是測序成本高、通量低，會嚴重影響全基因組測序的效率，非常有必要開發(fā)新的全基因組測序技術。

二代測序技術主要由Roche、Illumina和ABI三個公司主導分別推出了454、Solexa和Solid測序平臺。二代測序技術是在Sanger測序的基礎上進行改良[12]。首先進行預擴增：未標記的dNTP和普通Taq酶進行固相橋式PCR擴增，單鏈待測片段通過PCR生成雙鏈片段。高溫變性后解鏈得到互補的單鏈，固定在附近的固相表面，經過PCR循環(huán)后，可以得到大量的待測序單鏈片段。常用的固相有磁珠，帶有待測片段的磁珠在PTP的平板上反應，PTP平板上有許多孔，每個孔只能容下單個磁珠反應，然后在反應環(huán)境中加入四種不同顏色熒光標記的dNTP以及聚合酶進行PCR擴增，通過捕捉四種不同熒光信號，換算成信號峰值強度，再通過計算機軟件計算測序數值。相對于Sanger測序，二代測序技術最大的特點是實現了高通量，同時高通量測序一次可以讀取10~100萬條序列。在很大程度上降低了測序的成本，獲得大規(guī)模的基因組數據就成為了可能。但是，二代測序技術也存在較多的缺陷，其最大的一個不足就是測序片段較短，從而會對全基因組的后續(xù)分析造成較大的困難，導致測序之后出現較多的contigs，很難在短時間內拼接完成。對于一些GC含量較為極端的物種，就會出現大量contigs，導致難以拼接至染色體上，進而嚴重影響測序的進度。而解決這種困難的途徑，就需要構建一系列的DNA文庫，進行重測序工作，這同時也增大了工作量。見表1。

近兩三年以來，基因組測序技術取得了非常大的進步。其中以PacificBio公司的SMRT和OxfordNanopore technologies的納米孔技術最為突出，也被稱之為第三代測序技術[13，14]。第三代測序技術又稱之為“單分子測序技術”，與二代測序技術相比，其不需要經過PCR擴增，并且可以實現超長讀長。第三代基因組測序的基本原理是：基因組模板與DNA聚合酶結合之后，標有4種不同顏色熒光的dNTP，在堿基配對階段不斷地加入，檢測器可以通過檢測不同的熒光來判斷堿基序列。而與基因組模板結合的DNA聚合酶是實現三代測序超長讀長的重要因素之一。DNA聚合酶的活性直接影響到最終測序的讀長。而聚合酶的活性受到眾多因素的影響，包括測序前樣本的處理（其中是否含有酶的螯合劑、蛋白、RNA等）、上機測試是激光對酶活性的影響等等。因此，第三代測序技術對于基因組樣本質量要求較高。在基因組樣本制備的過程中，不能含有過高的蛋白，同時也不能含有聚合酶的抑制劑等污染物。通常，三代測序前都需要對基因組樣本質量進行測定，以確保后續(xù)實驗能夠順利地進行。第三代測序技術最大的優(yōu)勢，在于其超長的讀長（有時可以超過3，000bp），但是其最大的缺陷是測序的錯誤率較高。測序速度較快的SMRT技術的錯誤率可以達到15%，但好在錯誤率的出現是隨機性的，并不像二代測序技術具有偏向性。

綜上所述，每一種全基因組測序技術都有其優(yōu)勢及缺陷。當今，為了快速而準確地獲得全基因組數據，我們就需要結合不同的測序方法，發(fā)揮各種測序技術的優(yōu)勢，規(guī)避劣勢；從而能夠準確而快速的完成測序工作。

表1　各種二代測序方法及平臺的比較

3　基因組測序技術在臨床中的應用

3.1臨床微生物診斷以及微生物耐藥監(jiān)測傳統的微生物培養(yǎng)加藥敏通常需耗時一周左右，基因組測序可以在短時間內完成微生物的鑒定及藥敏，為臨床及時提供用藥指導，另外還可以克服藥敏鑒定儀種數據庫不完整和過時的缺點，避免誤診。

此外，基因組測序技術還可以為臨床微生物提供可靠的流行病學資料，對于醫(yī)院院內感染的控制和預防具有非常重要的作用。2012年，在The New England Journal of Medicine上發(fā)表了一篇關于新生兒感染MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）的全基因組報道[3]。

基因組測序技術不僅可以運用在臨床微生物的鑒定，同時也可以用于臨床微生物的藥敏結果檢測。例如多重耐藥的肺結核（簡稱“MTB”）和人類免疫缺陷病毒（簡稱“HIV”）的藥敏檢測，已經能夠通過基因組測序技術進行快速、準確地檢測。2013年，Jacqueline等在New England Journal發(fā)表了通過全基因組測序的方法，鑒定多重耐藥肺結核分枝桿菌的耐藥情況[15]。他們完成全基因組測序之后，發(fā)現分離得到的肺結核分枝桿菌基因組中共包含了39個耐藥基因，而標準化實驗室只報道了對其中的9種藥物耐藥。后期的表型實驗證實，該株肺結核分枝桿菌對amikacin，capreomycin，clofazimine和linezolid敏感?；蚪M數據與這一表型完全符合。此外，通過基因組測序，該研究小組還在amithiozone，gatifloxacin，levofloxacin，rifapentine 和rifabutin的作用位點中發(fā)現了突變，而這幾類藥物并沒有包含在標準化實驗室的報告中。因此，借助基因組測序技術，可以更加完整、快速、準確地了解臨床微生物的耐藥情況，為臨床治療選擇合適的藥物提供重要的支持[16]，很多報道將全基因組測序技術運用到臨床微生物的診斷[3，4，7，17，18]，為臨床微生物的診斷和治療提供重要依據。

3.2基因組測序技術在遺傳病和產前診斷中的應用。染色體異常檢測[19-21]：在基因測序出現之前，臨床上針對遺傳病主要是染色體培養(yǎng)，鏡檢染色帶型來診斷。染色體培養(yǎng)耗時長，效率低，檢測范圍有限。在測序技術出現后，2007年Korbel[22]等提出一種新的高通量分析方法，基因組配對對比法，首先將染色體打碎成基因片段，PCR擴增后進行基因組測序，得到整個基因組圖譜后與人類基因組參考圖片配對比對，可發(fā)現例如倒置，方向錯誤，序列長度不等等1000多個結構變異。在臨床中，染色體結構變異的常見類型有缺失、重復、倒位和易位4種，如貓叫綜合征，女性習慣性流產，可以導致慢性粒細胞白血病等；同時在臨床中還有許多遺傳病是因為基因點突變導致的。而通過傳統遺傳學染色異常來診斷是很受限制的，例如β－地中海貧血，其基因含1個41~42位點突變基因雜合子，傳統遺傳學方法敏感性很低，但是通過高通量測序則可以逐一檢測出異常位點，及時做出準確的診斷?；翁阂恢崩_廣大孕婦和醫(yī)生，雖然可以通過臍帶血或者羊水的染色體帶型來診斷一部分，但是這種傳統方法非常局限，而且具有較大風險，采用新一代高通量基因測序技術的基因芯片可準確檢測胎兒遺傳異常。翁惠男，梁嘉穎等[23]回顧了1800多例孕期12周以上的孕婦，發(fā)現無創(chuàng)產前基因測序高危孕婦，再通過臍帶血或者羊水細胞培養(yǎng)染色體分型(21－三體綜合征、18－三體綜合征、13－三體綜合征）。發(fā)現21－三體綜合征的敏感性為100%，準確性為92.9%。18－三體綜合征和13－三體綜合征的敏感性及準確性均為100%。無創(chuàng)產前胎兒基因檢測可提高產前診斷效率，其敏感性準確性與染色體帶型分析技術高度一致，可減少畸形胎兒的出生，且安全，較介入性產前診斷易于接受，具有較高的臨床實際應用價值[24]。

3.3基因測序技術與個性化醫(yī)療。個性化醫(yī)療即指精準醫(yī)療—基于個人基因組信息，為患者量身制定治療方案，是讓效果最大化而副作用最小化的最佳選擇。1.藥物基因組學，根據基因組來選擇最佳藥物種類和劑量，在保證安全的前提下達到最佳治療效果[25-28]。范宇飛等[29]，對25例腫瘤患者進行基因檢測，執(zhí)行個體化醫(yī)療，對比對照組發(fā)現實施個體化治可提高有效率，延長患者生存期。2.腫瘤及腫瘤遺傳學，目前對腫瘤的診斷，治療效果評價以及預后檢測都是通過測定血清中腫瘤標志物[21]。包括甲胎蛋白、癌胚抗原、同工酶、激素(人絨毛膜促性腺激素)、組織特異性抗原(前列腺特異性抗原、游離前列腺特異抗原)、黏蛋白、糖蛋白、糖脂(CAl25)的等。然而最新的基因測序技術可以捕獲腫瘤基因[30]，及時做出診斷，甚至預判腫瘤的發(fā)生，及時作出預防和早期干預。好萊塢知名女星安吉麗娜?朱莉通過測序技術確定帶有乳腺癌基因1號（BRCA1號）基因[21，32]，估測分別有87%和50%的概率患上乳腺癌和卵巢癌，結合她母親50歲左右因乳腺癌去世的家族病史，她接受了預防性的切除術以降低罹癌風險。基于基因測序技術的個性化醫(yī)療可精準診斷，降低分險，提供更加安全高效的治療方案。

4　展望

隨著全基因組測序技術的進一步發(fā)展，測序成本的進一步降低，將全基因組測序引入臨床診斷也將逐漸成為現實。一方面，不僅可以快速地診斷出一些常見及不常見的疾?。贿€可以預測許多疾病，通過早期干預和預防，降低發(fā)病率。另一方面，隨著技術的愈發(fā)成熟，測序技術從實驗室慢慢走向臨床，風靡全球，市場潛力巨大，但是政府部門卻缺少有效監(jiān)管和測序實驗室的準入制度，甚至沒有質量控制體系，2014年2月9號，中國國家食品藥品監(jiān)管總局、國家衛(wèi)生與計劃生育委員會聯合發(fā)布(25號文件)“臨床使用基因測序相關產品和技術管理的通知”，要求停止一切商用基因測序產品[33]。近期，政府已出臺基因測序相關政策，未來在政府有效監(jiān)管和質量監(jiān)控、技術準入制度的進一步完善下，基因測序技術會飛速發(fā)展，為臨床提供不可限量的幫助。

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·講座·

(收稿日期2015-11-30；修回日期2016-01-10)

通信作者：萬臘根，男，1964年12月生，主任技師，研究方向：從事臨床檢驗診斷及分子生物學，郵箱：wlgme196412@126.com

作者簡介：梁振山，男，1984年8月生，在讀碩士研究生，檢驗師，研究方向：從事臨床檢驗診斷及分子生物學。

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.016

中圖分類號：R446.62，Q751

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)01-0048-04