間接免疫熒光法在臺山地區(qū)艾滋病并發(fā)PCP的應(yīng)用

陳達富，邵筱(、廣東醫(yī)學(xué)院附屬臺山醫(yī)院，廣東臺山5900；、廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞5380)

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間接免疫熒光法在臺山地區(qū)艾滋病并發(fā)PCP的應(yīng)用

陳達富1，邵筱2
(1、廣東醫(yī)學(xué)院附屬臺山醫(yī)院，廣東臺山529200；2、廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523820)

摘要：目的比較間接免疫熒光法（IFA）與瑞-姬氏復(fù)合染色法、熒光實時定量PCR法（Real-time PCR）三種方法對肺孢子菌肺炎的差異，探討實驗室方法IFA在診斷肺孢子菌肺炎的應(yīng)用價值。方法通過回顧性分析，收集2013年1月至2015年8月間在我院經(jīng)病原學(xué)及臨床診斷確診的肺孢子菌肺炎（PCP）患者56例作為實驗組，另外收集60例非PCP感染的呼吸道疾病患者作為對照組，收集兩組患者的痰液和支氣管肺泡灌洗液(BALF)，分別用IFA、瑞-姬氏復(fù)合染色法、Real-time PCR對兩組的痰液和BALF進行檢測，比較三種方法的檢測結(jié)果。結(jié)果通過比較，IFA檢測與real-time PCR一致性極高，對痰液和BALF標本陽性檢出率均高于瑞-姬氏復(fù)合染色法，P<0.05，差異顯著。三種方法學(xué)對BALF的陽性檢出率明顯高于痰液，P<0.05。結(jié)論瑞-姬氏復(fù)合染色法由于方法學(xué)上的局限性，存在陽性率不高的問題。IFA無論對痰液或BALF的檢測靈敏度均高于瑞-姬氏復(fù)合染色法，與Real-time PCR一致性極高。IFA可以作為常規(guī)方法用于基層醫(yī)院PCP的檢測。在本研究中，瑞-姬氏復(fù)合染色法、IFA、Real-time PCR對BALF標本的檢測率高于痰液標本，臨床上建議盡量留取BALF標本，條件無法許可的情況可留取痰液標本。

關(guān)鍵詞：艾滋??；肺孢子菌；肺孢子菌肺炎；間接免疫熒光法；熒光實時定量PCR

卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii，PC)，簡稱肺孢子蟲，根據(jù)分子生物學(xué)的研究，其實是一種特殊的真菌[1]，現(xiàn)在已經(jīng)改稱為肺孢子菌更為恰當，它是一種機會致病感染病原體，其引起的肺炎稱為肺孢子菌肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia，PCP)。PC可在免疫功能低下的人群中誘發(fā)PCP，特別是AIDS患者容易發(fā)生PCP[2-4]。PCP是艾滋病患者最常見的感染和死亡原因之一[5]。目前國外已對AIDS患者等易感人群實施越來越多的PCP預(yù)防治療，但在國內(nèi)對PCP的早期診斷和治療仍然有相當?shù)碾y度[6]，由于誤診而延誤治療導(dǎo)致PCP患者病死率極高?，F(xiàn)在PCP的確診主要依據(jù)是靠在呼吸道分泌物里找到病原體PC[7]。臺山地區(qū)一直是我國AIDS的高發(fā)區(qū)域，在臺山地區(qū)建立高靈敏度、高特異性的診斷方法有重要意義。本研究對間接免疫熒光法（IFA）進行研究分析，探討其在診斷PCP中的應(yīng)用價值。

1　資料與方法

1.1一般資料通過回顧性分析，收集2013年1月至2015年8月間在臺山市人民醫(yī)院HIV陽性合并PCP患者56例作為實驗組，另外收集60例非PCP感染的呼吸道疾病患者作為對照組，收集兩組患者的痰液和支氣管肺泡灌洗液(BALF)，分別用IFA與瑞-姬氏復(fù)合染色法、Real-time PCR對兩組的痰液和BALF進行檢測，比較三種方法的檢測結(jié)果。

1.2標本采集

1.2.1痰液的留取能正常留取濃痰患者只需清潔口腔留取，無痰患者用3%的高滲鹽水超聲霧化吸入誘導(dǎo)排痰，在痰液中加人10%NaOH，于37℃水浴消化1h取出，經(jīng)4500r/min離心5min留取沉淀物。

1.2.2支氣管肺泡灌洗液（BALF）的留取通過3300型電子纖維支氣管鏡，向肺內(nèi)灌入無菌生理鹽水，反復(fù)多次回收灌洗液約10~30m l，經(jīng)4000r/ min離心20min，取沉淀物檢查。備注：留取BALF要注意患者是否能夠耐受。

1.3儀器與試劑日本OLYMPUS公司CX40型普通光學(xué)顯微鏡；日本OLYMPUS公司IX81熒光顯微鏡；日本OLYMPUS公司3300型電子纖維支氣管鏡；廣州達安公司DA7600PCR定量分析儀；珠海貝索生物技術(shù)有限公司瑞特染液和吉姆薩(Giesma)染色液；法國歐蒙公司間接免疫熒光肺孢子菌試劑盒；上海之江生物科技有限公司肺孢子菌熒光實時定量試劑盒。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，計量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（±s）或百分比（%）表示。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換正態(tài)化分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

瑞-姬氏復(fù)合染色法、IFA、Real-time PCR對實驗組和對照組痰液標本的檢測結(jié)果見表1，對BALF的檢測結(jié)果見表2。

表1　實驗組和對照組三種方法對痰液的檢測結(jié)果

從表1和表2中，IFA、Real-time PCR兩種方法學(xué)對BALF的陽性檢出率均高于痰液。IFA和Real-time PCR一致性高，對痰液和BALF的陽性檢出率均高于瑞-姬氏復(fù)合染色法。

三種方法學(xué)對痰液、BALF的靈敏度和特異性比較見表3。

表3　三種方法學(xué)對痰液、BALF的靈敏度和特異性比較

從表3可見，IFA與瑞-姬氏復(fù)合染色法特異性均高于Real-time PCR，靈敏度IFA和Real-time PCR高于瑞-姬氏復(fù)合染色法。三種方法學(xué)BALF的檢測靈敏度高于痰液的檢測。

3　討論

艾滋病(AIDS)是獲得性免疫缺陷綜合征的簡稱，選擇性侵犯帶有CD4分子的T淋巴細胞，導(dǎo)致CD4+T淋巴細胞進行性減少。致機體免疫力下降，常使HIV患者合并各種機會性感染[8]。臺山地區(qū)為HIV的高發(fā)區(qū)域，臺山市疾病控制中心也對此進行了相關(guān)文獻[9，10]報道，而PCP是AIDS患者的常見的肺部感染[11]，死亡率高，所以在基層醫(yī)院急需靈敏度更高的方法應(yīng)用于臨床實驗室診斷。瑞-姬復(fù)合染色法是目前較為公認的確診PCP的傳統(tǒng)方法，但由于瑞-姬復(fù)合染色效果的差異及檢驗人員主觀判斷的差異，往往存在陽性率不高的問題。目前，研究較多的PCR方法學(xué)已經(jīng)較多地應(yīng)用到實驗室中，但其靈敏度過高，容易引起假陽性，造成病人的過度治療。

IFA因其特異性強、靈敏高、速度快等優(yōu)點在國外已經(jīng)普遍應(yīng)用于實驗室[12]，國外學(xué)者Hassan等認為IFA檢測PC抗原的敏感性達100%[13]。但在國內(nèi)的研究還較少。本研究中，間接免疫熒光法（IFA）對痰液標本和BALF標本檢出靈敏度達到98.29%和94.64%，特異性均達到100%。通過對IFA、瑞-姬復(fù)合染色法與real-time PCR的比較，IFA與real-time PCR均有較高的靈敏度，而且比瑞-姬復(fù)合染色法有更好的靈敏度及更強的特異性。這是因為抗原抗體反應(yīng)結(jié)合特異性比較高，而且人眼對熒光的辨認比較敏感，提高了標本的陽性檢測率，同時減少了組（人員）間的主觀差別?？傊?，本研究證實IFA操作簡單，對痰液和BALF的檢測均能滿足臨床需求，可以在基層醫(yī)院進行推廣應(yīng)用。

通過本研究可知，縱觀三種方法學(xué)對痰液和BALF的檢測，均一致顯示BALF檢測陽性率高于痰液，痰液標本容易獲取，而且對病人創(chuàng)傷性較少，但其有對PC的檢出陽性率低的缺點，而且PCP患者往往存在痰液過少，難以留取的問題。有學(xué)者Gupta[14]就提出用BALF作為首選標本，學(xué)者Rodifio[15]也認為BALF的診斷率高，本研究基本與相關(guān)的研究相符，所以如果病人能夠耐受，BALF是比較佳的選擇。

參考文獻

[1]Santamauro JT，Stover DE.Pneumocystis carinii pneumonia[J]．Med Clim North Am.1997，81(2)：299-318.

[2]Nakase K，Tsuji K，Nagaya S，et al.Acute interstitial pneumonitis during chemotherapy for haematologicalmalignancy[J].Eur JCancer Care(Engl)，2005，14(4)：336-341.

[3]Calderon EJ，Rivero L，Respaldiza N，et al．Systemic inflammation in patients with chronic obstructive pulmonary disease who are colonized with Pneumocystis jiroveei[J]．Clin Infect Dis，2007，45 (2)：el7-19．

[4]韓晶，尼宏莉，常志尚，等．艾滋病并發(fā)肺孢子蟲肺炎的診斷和防治[J]．青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，40(2)：92-95．

[5]林睿，黎學(xué)銘，張陸娟，等．AIDS患者合并感染耶氏肺孢子蟲的

巢式PCR檢測及ITS基因的克隆測序[J]．應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，15(4)：198-202．

[6]Deep A，Bhure SU，Bhure UN，et al．Efficacy of 99mTc-DTPA Lung Clearance Test in the Diagnosis of PCP in HIV[J].J Trop Pediatrics，2009，55(2)：97-102.

[7]陳敬捷，何晗，蘇凌松，等.艾滋病合并肺孢子蟲肺炎的實驗室診斷方法進展[J].中國臨床新醫(yī)學(xué)，2011，4(6)：571-574.

[8]齊曉彤，謝南，李金明，等.臨床艾滋病患者合并病原微生物感染的分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2012，30(5)：492-493.

[9]羅偉強，余大年，楊忠偉，等.2001-2012年臺山市艾滋病流行病學(xué)分析[J].職業(yè)與健康，2013，29(14)：2-3．

[10]劉文錦，余大年，梁僑任．臺山市艾滋病流行狀況分析[J]．國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)，2009，15(14)：220-223．

[11]Knvacs JA，Masur H．Evdving health effects of Pneumocystis：one hundred years of progress in diagnosis and treatment[J].JAMA， 2009，301(24)：2578-2585．

[12]Baselski VS，Robison MK，Pifer LW．Rapid detection of Pneumocystis carinii in bronchoalveolar lavage samples by using cellufluor staining[J]．Clin MicrobioI，1992，30(3)：754

[13]王建成，郭增柱．卡氏肺孢子蟲肺炎實驗室診斷研究進展[J]．臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2002，1(3)：193-196．

[14]Gupta R，Iyer VK，Mirdha BR，et al．Role of cytology and polymerase chain reaction based detection of Pneumocystis jirovecii infection in bronchoalveolar lavage fluid[J]．Acta Cytol，2010，54(3)：296-302．

[15]Rodifio J，Rincón N，Agnilar YA，et al．Microscopic diagnosis of Pneumocystis jirovecii pneumonia in bronchoalveolar lavage and oropharyngeal wash samples of immunocompromised patients with pneumonia[J]．Biomedica，2011，31(2)：222-231．

·綜述·

(收稿日期2015-10-26；修回日期2015-12-29)

通信作者：邵筱，男，1976年6月出生，博士，研究生導(dǎo)師，大學(xué)講師，主要研究方向：病原生物學(xué)。

作者簡介：陳達富，男，1981年7月出生，主管技師，本科，學(xué)士學(xué)位，主要研究方向：生物化學(xué)檢驗與微生物檢驗。

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.010

中圖分類號：R512.91，R446.62

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)01-0029-02