基于激光共聚焦顯微鏡λ掃描檢測蒿草切片熒光光譜的研究

吳偉全，李元歌，王思捷，楊騰，吳平(、廣東醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東湛江5400；、廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，廣東湛江5400)

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基于激光共聚焦顯微鏡λ掃描檢測蒿草切片熒光光譜的研究

吳偉全1，李元歌2，王思捷1，楊騰1，吳平1
(1、廣東醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東湛江524001；2、廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，廣東湛江524001)

摘要：目的研究激光掃描共聚焦顯微鏡λ掃描檢測蒿草切片的熒光光譜，為基于共聚焦顯微鏡獲得生物醫(yī)學(xué)樣本的熒光光譜提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法運(yùn)用普通熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡分別觀察熒光染色的蒿草切片，實(shí)驗(yàn)分為三組：A組用普通熒光顯微鏡觀察并拍照；B組用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測熒光光譜；C組用激光掃描共聚焦顯微鏡掃描熒光圖像。結(jié)果熒光顯微鏡可以觀察到蒿草切片的熒光圖像，但不能準(zhǔn)確獲取其相應(yīng)熒光激發(fā)和發(fā)射波長，而且會(huì)發(fā)生串色干擾現(xiàn)象。激光掃描共聚焦顯微鏡能對蒿草切片進(jìn)行熒光光譜掃描，排除了干擾波長，獲取其熒光激發(fā)和發(fā)射波長，得到高清晰度的熒光圖像。結(jié)論與普通熒光顯微鏡比較，激光掃描共聚焦顯微鏡有能準(zhǔn)確獲取樣本熒光光譜，得到高清晰度熒光圖像的優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：激光共聚焦顯微鏡；蒿草切片；熒光；光譜分析

隨著生物醫(yī)學(xué)的研究發(fā)展，獲得生物醫(yī)學(xué)樣本的熒光光譜在生物醫(yī)學(xué)研究中越來越重要[1]。熒光顯微鏡可以觀察到其熒光圖像，但不能準(zhǔn)確獲取其相應(yīng)熒光激發(fā)和發(fā)射波長[2]。隨著激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)的發(fā)展，其λ掃描功能可以掃描生物醫(yī)學(xué)樣本的熒光光譜，但目前相關(guān)的研究較少，有待深入研究[3]。因此本研究使用激光掃描共聚焦顯微鏡λ掃描功能檢測生物醫(yī)學(xué)樣本的熒光光譜，獲取其相應(yīng)的熒光激發(fā)和發(fā)射波長，并準(zhǔn)確獲得其熒光圖像，為基于激光掃描共聚焦顯微鏡獲得生物醫(yī)學(xué)樣本的熒光光譜提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1材料與儀器采用德國Leica公司廣州分公司的多種混合熒光染料染色蒿草切片，蒿草切片制片共有18張，分為A、B、C三組，每組6張。A組用普通熒光顯微鏡觀察并拍照；B組用激光掃描共聚焦顯微鏡λ掃描檢測其的熒光光譜；C組用激光掃描共聚焦顯微鏡掃描其熒光圖像。Leica T CSSP5 II激光掃描共聚焦顯微鏡（德國）；奧林巴斯IX70普通熒光顯微鏡（日本）。

1.2普通熒光顯微鏡觀察蒿草切片并拍照蒿草切片制片后置于奧林巴斯IX70熒光顯微鏡載物臺(tái)上，分別以紫外光（360~380nm）、藍(lán)光（460-490nm）、綠光（520-550nm）為激發(fā)光源激發(fā)樣品，觀察圖像，圖像由Leica DFC295數(shù)碼攝像頭拍攝記錄。

1.3激光共聚焦掃描顯微鏡λ掃描分析蒿草切片，LAS軟件分析其熒光光譜蒿草切片制片后置于德國Leica公司的TCSSP5激光掃描共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上，調(diào)焦選擇理想的掃描層面。分別用405nm、488nm、543nm等3種波長激發(fā)光激發(fā)樣品進(jìn)行λ掃描分析。掃描模式為xyλ，分辨率（format）為1024×1024；掃描速度(speed)為200Hz；針孔大小(pinhole)為1Airy；放大倍數(shù)(zoom)為1.0，接收的帶寬(Band Width)為5nm。掃描蒿草切片的熒光光譜，每張片掃描3次。采用Leica LAS軟件分析其熒光光譜，獲取其相應(yīng)熒光激發(fā)和發(fā)射波長范圍。

1.4激光掃描共聚焦顯微鏡掃描獲取蒿草切片熒光圖像基于激光掃描共聚焦顯微鏡，輸入Leica LAS軟件分析獲得的蒿草切片相應(yīng)熒光激發(fā)和發(fā)射波長，掃描方式（mode）為XYZ；分辨率（format）為1024×1024；掃描速度(speed)為200Hz；針孔大小(pinhole)為1Airy；放大倍數(shù)(zoom)為1.0。手動(dòng)調(diào)節(jié)Z軸位置至清晰的焦平面，掃描獲取二維平面圖像。

2　結(jié)果

2.1普通熒光顯微鏡觀察蒿草切片的熒光圖像紫外光（波長360~380nm）激發(fā)得到的蒿草切片藍(lán)色熒光圖像；藍(lán)光（波長460~490nm）激發(fā)得到的蒿草切片熒光圖像，呈黃色，綠色光為主，與串色的紅色光疊加所致；綠光（波長520~550nm）激發(fā)得到的蒿草切片紅色熒光圖像。（見圖1A、1B和1C）

圖1　普通熒光顯微鏡觀察并拍照（×40）

2.2激光掃描共聚焦顯微鏡λ掃描分析蒿草切片的熒光光譜用405nm、488nm和543nm波長激發(fā)光分別激發(fā)樣品進(jìn)行λ掃描，LAS軟件分析光譜峰值，得到相應(yīng)敏感的熒光發(fā)射波長范圍分別為490~510nm、510~530nm和560~580nm。（見圖2A、2B和2C）

圖2　激光掃描共聚焦顯微鏡λ掃描分析蒿草切片的熒光光譜

2.3激光掃描共聚焦顯微鏡掃描獲取蒿草切片熒光圖像用405nm、488nm和543nm波長激發(fā)光分別激發(fā)樣品，對應(yīng)使用其相應(yīng)敏感的熒光發(fā)射波長范圍為490-510nm、510-530nm和560-580nm，分別可以得到清晰的蒿草切片共聚焦熒光圖像（見圖3A、3B和3C）。

圖3　激光掃描共聚焦顯微鏡掃描獲取蒿草切片熒光圖像（×100）

3　討論

生物醫(yī)學(xué)樣本的熒光光譜已經(jīng)成為研究其性質(zhì)和功能一個(gè)重要方法[4]。但目前很多生物醫(yī)學(xué)樣本的熒光光譜是未知的[5]。隨著生物醫(yī)學(xué)的研究發(fā)展，獲取生物醫(yī)學(xué)樣本的熒光光譜，從而準(zhǔn)確采集生物醫(yī)學(xué)樣本的熒光圖像在生物醫(yī)學(xué)研究中越來越重要。

熒光顯微鏡是研究生物醫(yī)學(xué)樣本的基本工具，是用一定波長的光去激發(fā)標(biāo)本，從而發(fā)射出熒光，然后通過物鏡和目鏡系統(tǒng)可以觀察到標(biāo)本的熒光圖像[6-8]。熒光顯微鏡可以觀察到部分未知熒光光譜的生物醫(yī)學(xué)樣本熒光圖像，但不能準(zhǔn)確獲取其相應(yīng)熒光激發(fā)和發(fā)射波長，而且多種熒光染料染色時(shí)會(huì)發(fā)生串色干擾現(xiàn)象[9]。本研究中的普通熒光顯微鏡圖像結(jié)果也反映了這個(gè)現(xiàn)象。

激光掃描共聚焦顯微鏡是一種新型的先進(jìn)的光學(xué)顯微鏡，用激光做光源，采用共軛聚焦原理和裝置，避免了衍射光和散射光的干擾，并利用計(jì)算機(jī)對所觀察的對象進(jìn)行數(shù)字圖像處理觀察、分析和輸出，因而其圖像清晰度高[10-12]。與普通熒光顯微鏡相同樣本的圖像比較，本研究顯示激光掃描共聚焦顯微鏡的圖像清晰度較高，與相關(guān)研究一致[13，14]。隨著激光掃描共聚焦顯微鏡的快速發(fā)展，其λ掃描功能可以掃描生物醫(yī)學(xué)樣本的熒光光譜。本研究通過λ掃描對生物醫(yī)學(xué)樣本進(jìn)行光譜掃描，再采用軟件分析其熒光光譜，排除了干擾波長，獲取其相應(yīng)的熒光激發(fā)和發(fā)射波長，并且根據(jù)其激發(fā)和發(fā)射波長進(jìn)一步掃描得到了高清晰度的共聚焦熒光圖像。

蒿草為一種草本植物，莖呈圓柱形。其莖斷面結(jié)構(gòu)清楚，熒光染色容易，制成切片很適合顯微鏡觀察[15]。本研究通過激光掃描共聚焦顯微鏡λ掃描檢測蒿草切片的熒光光譜，明確其相應(yīng)熒光激發(fā)和發(fā)射波長，為生物醫(yī)學(xué)樣本熒光光譜分析提供新思路，為將來基于激光掃描共聚焦顯微鏡獲得生物醫(yī)學(xué)樣本的未知熒光光譜提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有一定的科學(xué)價(jià)值，社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。

參考文獻(xiàn)

[1]De Almeida Brehm F，de Azevedo JC，da Costa Pereira J，et al.Direct estimation of dissolved organic carbon using synchronous fluorescence and independent component analysis(ICA)：advantages of amultivariate calibration[J].Environ Monit Assess，2015，187(11)：703.

[2]Kijani S，Yrlid U，Heyden M，et al.Filter-Dense Multicolor Microscopy[J].PLoSOne，2015，10(3)：e0119499.

[3]Nichols AJ，Evans CL.Video-rate scanning confocal microscopy andmicroendoscopy[J].JVis Exp，2011，(56).pii：3252.

[4]Kitada M，Ohsaki Y，Matsuda Y，et al.Photodynamic Diagnoses of Malignant Pleural Diseases Using the Autofluorescence Imaging System[J].Ann Thorac Cardiovasc Surg，2014，20(5)：378-382.

[5]Claes JM，Mallefet J.Control of luminescence from lantern shark (Etmopterus spinax)photophores[J].Commun Integr Biol，2011，4 (3)：251-253.

[6]Fero M，Pogliano K.Automated quantitative live cell fluorescence microscopy[J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2010，2(8)：a000455.

[7]孫振，尹合勇，眭翔，等.冰凍切片法觀察不脫鈣骨組織的熒光分布[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2015，29(7)：1429-1433.

[8]鄧紀(jì)望，蔡燕玲，何以雅.不同熒光模式ANA、ASMA在自身免疫性肝炎與慢性丙型肝炎中的診斷價(jià)值[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，28(2)：147-148.

[9]Stemmer A，Beck M，F(xiàn)iolka R.Widefield fluorescence microscopy with extended resolution[J].Histochem Cell Biol，2008，130(5)：807-817.

[10]Hanrahan O，Harris J，Egan C.Advanced microscopy：laser scanning confocal microscopy[J].Methods Mol Biol，2011，784(20)：169-180.

[11]Collings DA.Optimisation approaches for concurrent transmitted light imaging during confocal microscopy[J].Plant Methods，2015，11：40.

[12]吳偉全，李元歌，王思捷，等.CO2及溫度對顯微活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞Ca2+變化的影響[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，30(6)：541-545.

[13]王碩，梁紅艷，姚玉虹，等.探索雙重?zé)晒馊旧⒗脙煞N不同顯微鏡在Hep-2細(xì)胞上觀察抗核抗體熒光模式的臨床價(jià)值[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2015，22(9)：931-935.

[14]佘俊萍，張錫林，王光西，等.三種顯微技術(shù)對人毛囊蠕形螨的觀察和研究[J].四川動(dòng)物，2011，30(1)：47-49.

[15]吳偉全，李元歌，王思捷，等.基于蒿草切片對比分析激光共聚焦系統(tǒng)的三維重構(gòu)成像及二維平面成像的應(yīng)用價(jià)值[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2013，13(7)：21-23.

Study on the fluorescence spectrum of wormwood slice w ith laser scanning confocalm icroscope

WUWeiquan1，LIYuange2，WANG Sijie1，YANG Teng1，WU Ping1.1.Clinical Research Center，Guangdong Medical University，Zhanjiang Guangdong 524001，China；2.Radiology Department，Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang Guangdong 524001，China.

Abstract：Objective To study the fluorescence spectrum of wormwood slice with laser confocalmicroscope，and provide the theoretical and experimental basis for obtaining the fluorescence spectrum of biomedical samples.M ethods The fluorescencemicroscope and laser scanning confocalmicroscope were used to observe fluorescence of wormwood slice.The experiment included three groups：group A，using fluorescence microscope to take photos；group B，using laser scanning confocalmicroscope to detect fluorescence spectrum；group C，using laser scanning confocalmicroscope to obtain fluorescence image.Results The fluorescence microscope could observe the fluorescence image of wormwood slice，but could not accurately obtain the corresponding fluorescence excitation and emission wavelength.The channeling color interference phenomenon was occurred.The laser scanning confocalmicroscope could scan the fluorescence spectrum of wormwood slice，exclude the interference wavelength，obtain the fluorescence excitation and emission wavelength accurately and gather fluorescent image with high-resolution.Conclusion Compared with the fluorescence microscope，the laser scanning confocal microscope can accurately obtain the fluorescence spectrum and high-resolution fluorescence image of biomedical samples.

Key words：Laser scanning confocalmicroscope；Thewormwood slice；Fluorescence；Spectral analysis

(收稿日期2015-11-11；修回日期2015-12-30)

通信作者：吳平，主任技師，主要從事醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究。

作者簡介：吳偉全，男，1978年5月生，碩士學(xué)位，助理研究員，主要研究方向：共聚焦相關(guān)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究。E-mail:wwqjob@163.com

基金項(xiàng)目：廣東醫(yī)學(xué)院科研基金項(xiàng)目（M2014044）

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.007

中圖分類號(hào)：R318.51

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-1129(2016)01-0021-03