弓形蟲病診斷方法研究進展

馮嘉軒，趙永坤，孟繁平，吳澤民，劉　智，李　娜，劉　全

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弓形蟲病診斷方法研究進展

馮嘉軒，趙永坤，孟繁平，吳澤民，劉智，李娜，劉全

［摘要］弓形蟲病是由弓形蟲感染引起的一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，對人類健康造成極大威脅。本文對弓形蟲病診斷技術，包括不依賴DNA檢測診斷方法、血清學檢測以及基于寄生蟲核酸的分子生物學方法進行綜述，為弓形蟲病診斷技術和方法的發(fā)展提供新的思路。

［關鍵詞］弓形蟲??；分子生物學；診斷

DOI∶ 10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.004

弓形蟲是可以感染包括人在內(nèi)的絕大多數(shù)溫血動物的專性細胞內(nèi)寄生蟲，屬于頂端復合物亞門、孢子蟲綱、真球蟲目、弓形蟲科、弓形蟲屬。弓形蟲生活史分為速殖子（又稱滋養(yǎng)體）、包囊、裂殖體、配子體和卵囊，前3期為無性生殖，后2期為有性生殖，僅在終宿主腸黏膜上皮細胞內(nèi)發(fā)育造成局部感染。一般情況下，人感染弓形蟲后無明顯癥狀，但是免疫力低下或患免疫功能缺陷病時，可引起弓形蟲病。弓形蟲病是一種重要的人獸共患寄生蟲病，具有流行范圍廣、感染率較高、臨床癥狀復雜等特點，全世界約有20億人感染過弓形蟲，對人類健康造成極大威脅［1-3］。

弓形蟲病分為先天性弓形蟲病和獲得性弓形蟲病?；疾〉脑袐D通過胎盤屏障將弓形蟲傳染給胎兒，妊娠早期感染可導致流產(chǎn)、畸形、死胎等，妊娠晚期可導致新生兒隱性感染，新生兒出生時即可出現(xiàn)腦內(nèi)病變、消化道癥狀和皮膚癥狀等。雖然患先天性弓形蟲病的新生兒存活率較高，但絕大多數(shù)伴精神發(fā)育障礙、視力發(fā)育障礙甚至運動障礙，患病新生兒最常見的死亡原因是融合性肺炎［4-5］。獲得性弓形蟲病是由于食用半生或全生的含有弓形蟲包囊的肉類食品，與寵物（主要是貓）或家畜家禽密切接觸后，弓形蟲可經(jīng)黏膜和損傷皮膚進入人體。獲得性弓形蟲病病情輕重不一，淋巴結腫大在免疫功能正常的患者中最為多見，免疫缺陷者如AIDS和惡性腫瘤患者等常有顯著全身癥狀如高熱、全身疼痛、嘔吐甚至合并腦炎、心肌炎等，最嚴重可導致死亡［6］。

弓形蟲病對人類健康、優(yōu)生優(yōu)育、公共衛(wèi)生及畜牧業(yè)發(fā)展都有極大的威脅，對弓形蟲檢測及診斷的研究愈發(fā)受到關注，本文對此進行綜述。

1　病原學診斷

1.1顯微鏡鏡檢傳統(tǒng)顯微鏡可檢測到糞便、水、環(huán)境和組織樣本中的弓形蟲，但靈敏度低，結果可靠性不高。糞便、水和環(huán)境中的卵囊須從大量樣本中過濾之后才能進行顯微鏡觀察。組織樣本中的包囊可直接通過染色與宿主細胞鑒別，吉姆薩染色和HE染色通常為染色包囊的主要方法，簡便有效；糖原染色可將裂殖子的支鏈淀粉酶顆粒染色，但相對費時，同時要求操作熟練才能得到比較滿意的結果。此外，電鏡可直接檢測到小鼠大腦內(nèi)和貓小腸組織的包囊，但該法不適用于常規(guī)檢測［7-8］。

1.2動物接種通過實驗動物對弓形蟲進行分離鑒定是弓形蟲病診斷的“金標準”，小鼠和貓是分離弓形蟲常用的實驗動物［9］，分泌物、排泄物、血液、淋巴結、肌肉和腦組織都是須要獨立檢測的樣本。為提高分離鑒定的成功率，常采用對弓形蟲更具有易感性的INF-γ基因敲除小鼠，或通過自由飲用地塞米松的方式對正常小鼠進行免疫抑制。貓的肌肉組織中可檢測到少量有活性的弓形蟲。雖然通過動物接種診斷弓形蟲的方法可靠性高，但由于檢測周期較長，不適用于大量樣本篩查。

2　影像學診斷

成像技術包括CT、MRI和超聲波，成像技術便于診斷弓形蟲病定位病灶，可作為輔助診斷弓形蟲病的方法，但監(jiān)測治療效果不具有特異性［10］。CT可對免疫缺陷患者感染弓形蟲后發(fā)生腦炎和腦膿腫進行最初步的檢測，也可檢測弓形蟲病嬰兒彌散性腦積水和腦鈣化。MRI常用于檢測損傷程度及范圍。超聲波是先天性弓形蟲病產(chǎn)前診斷的重要方法之一。

3　血清學診斷

多數(shù)個體在感染弓形蟲時無明顯特異性的臨床表現(xiàn)，診斷多依靠血清學檢測。不同的血清學檢測方法可用于檢測不同的抗原或抗體。IgM可檢測出1周到幾個月甚至數(shù)年的感染，所以不能作為急性感染的有效指標；IgA檢測比IgM出現(xiàn)更早，可以持續(xù)幾個月，因此可以作為急性感染的診斷指標；IgE出現(xiàn)的時間較短，可做為正在感染期間的判斷標準；IgG的出現(xiàn)只能提示有感染發(fā)生，但是不能確定感染時間［11-12］。

3.1染色試驗（dye test， DT）DT可稱為最經(jīng)典的特異性血清方法，速殖子在有致活因子的參與下與樣本的特異性抗體發(fā)生作用，導致蟲體表面膜被破壞，可被美蘭染色。鏡檢蟲體被藍染為陰性，反之為陽性。但其主要缺點是必須要求活的寄生蟲體和健康人血清，具有較高的危險性，檢測具有一定的局限性［13］。DT過程中使用細胞培養(yǎng)的方式獲得速殖子，會出現(xiàn)一定比例的假陰性結果，因此直接從小鼠體內(nèi)獲得速殖子具有準確性。

3.2酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）ELISA由于操作簡便，可用于大規(guī)模樣本的自動檢測，反應體系包括固相的抗原或抗體、酶標的抗原或抗體及酶反應底物。ELISA主要分為3類：①間接ELISA，該方法可檢測到抗弓形蟲IgG、IgM和IgA，常用的包被抗原是速殖子裂解抗原（tachyzoite lysate antigen， TLA）。隨著技術的不斷改進，將精確的抗原與蛋白質(zhì)重組并標準化形成重組蛋白，可在大腸桿菌及酵母中表達，抗原種類包括致密性顆?？乖℅RA1、GRA2、GRA4、GRA6、GRA7和 GRA8）、弓形蟲棒狀體蛋白（ROP1和ROP2）、基質(zhì)蛋白MAG1、微線體蛋白（MIC2、MIC3、MIC4和MIC5）以及表面抗原（SAG1和SAG2）［14-19］。重組抗原的結果與單一抗原比較，更具敏感性和特異性。例如SAG2A、GRA2、GRA4、ROP2、GRA8和GRA7可用于檢測人體由于近期感染出現(xiàn)的IgG；ROP1、SAG1、GRA7、GRA8和GRA6可檢測IgM；GRA7和GRA8可檢測IgA。②雙抗體夾心法ELISA，可檢測弓形蟲循環(huán)抗原，使用TLA的雙抗體夾心ELISA檢測人體內(nèi)的IgM比間接熒光抗體試驗法更敏感，急性感染時使用P35檢測IgM比使用TLA更有特異性。使用由2個不同物種制備的抗MIC10抗體檢測MIC10循環(huán)抗原，可為早期弓形蟲病提供診斷依據(jù)［20-21］。③Dot-ELISA法，抗原抗體結合在聚苯乙烯板的硝酸纖維膜上，與常規(guī)ELISA相比操作更簡單，無需特殊儀器。

3.3改良凝集試驗（modified agglutination test，MAT）在MAT過程中，速殖子使用福爾馬林固定，將其加入U型微量滴定板中，再加入稀釋過的待測血清進行檢測。若在滴定孔中出現(xiàn)一層薄薄的片狀凝集物質(zhì)，血清樣本測定結果為陽性；在孔底部出現(xiàn)由速殖子形成的致密顆粒沉淀，則結果為陰性。由于寄生蟲表面粘附有正常的IgM，會導致MAT的敏感性和特異性降低，所以在實驗過程中須向緩沖液中加入2-巰基乙醇，去除抗原表面非特異性的IgM［22-23］。通過MAT可檢測到大多數(shù)種屬宿主的IgG抗體，但是急性感染發(fā)生的早期可能出現(xiàn)假陰性結果。MAT操作簡便，與DT相比更具有特異性和敏感性，廣泛應用于實驗室診斷及流行病學調(diào)查。

3.4乳膠凝集試驗（latex agglutination test， LAT）LAT是將乳膠顆粒包被可溶性抗原，并加入待檢測血清中觀察凝集現(xiàn)象，若感染弓形蟲則會出現(xiàn)凝集反應。LAT可方便快速地檢測抗弓形蟲IgG抗體，通常做為一種流行病學的篩查方法。若出現(xiàn)陽性結果，則需要其他血清學檢測以便進一步檢查。

改良LAT可檢測抗弓形蟲IgM抗體，由此判斷是否在近期感染弓形蟲。分離出微粒體抗原Sp-2可與抗弓形蟲抗體結合，與IgG和IgM的反應隨濃度不同產(chǎn)生變化，只有當乳膠顆粒濃度≤100 μg/mg抗原時，Sp-2抗原與IgM結合發(fā)生反應［24］。根據(jù)該抗原的獨特反應，可以利用蛋白酶-K處理的抗原包被的微粒建立LAT檢測人體IgM抗體，可有效排除IgG抗體、風濕因子或抗核抗體的干擾［25］。

3.5間接血凝試驗（indirect hemagglutination test，IHA）將抗體包被于紅細胞表面，成為致敏的載體，然后與弓形蟲的可溶性抗原結合并發(fā)生凝血，即為陽性。IHA對弓形蟲急性感染和先天性感染比較不敏感，但IgG-IHA檢測簡單快速，因此廣泛應用于流行病學調(diào)查。通過建立IgM-IHA檢測模型，將弓形蟲可溶、堿性且具有熱穩(wěn)定性提取物包被于成熟穩(wěn)定的人類紅細胞，將該模型用于人類急性弓形蟲病的血清學檢測，其靈敏度達到100％，特異性達到98.5％［26］。

3.6間接熒光抗體試驗（indirect fluorescent antibody test， IFAT）IFAT是檢測IgG和IgM抗體的簡易試驗，并廣泛應用于檢測人及動物的弓形蟲抗體。將已失去活性的弓形蟲速殖子置于血清中進行培養(yǎng)，加入熒光抗物種抗體，通過熒光顯微鏡下觀察結果。結果提示其靈敏度為80.4％～100％，特異度為91.4％～95.8％。熒光標記的抗體在不同物種之間可以通用，該方法相對比較便宜，但是肉眼觀察可能導致結果有一定偏差［27-28］。

3.7免疫吸附凝集試驗（immunosorbent agglutination assay， ISAGA）抗人IgM抗體包被微量滴定板，加入血清37 ℃孵育2 h，洗板后加入速殖子懸濁液，在37 ℃潮濕溫室中孵育過夜。人血清中的特異性IgM與抗人IgM和寄生蟲粘附固定抗原結合，該法比IgM-ELISA更簡便易行，但要求大量的弓形蟲速殖子［29］。IgM-ISAGA通過使用弓形蟲速殖子代替乳膠顆粒包被可溶性抗原，可用于診斷弓形蟲急性感染和先天性感染。

3.8免 疫層析 法（immunochromatographic test，ICT）該法通過膠體金標記抗原或抗體作為示蹤物，并使用纖維素膜作為固體支撐。待檢測的抗原或抗體滴在硝酸纖維膜的樣品板上，通過虹吸現(xiàn)象緩慢滲透共軛墊，抗原抗體復合物呈現(xiàn)出膠體金反應。在弓形蟲急性感染早期（2～4 d）可使用膠體金交聯(lián)的抗排泄/分泌物抗原IgG抗體進行快速ICT［12］。與ELISA相比結果具有一致的敏感性和特異性，操作簡便快速，無需特殊儀器，適合廣泛應用。

3.9蛋白免疫印跡試驗（western-blotting， WB）WB是血清與弓形蟲抗體在膜上發(fā)生反應后轉移到聚丙烯酰胺凝膠上，產(chǎn)生的條帶與已知的分子量相比對而得到結果。WB靈敏度達到100％，檢測人唾液中的特異性抗弓形蟲IgG抗體的特異度可達98.5％，但對于弓形蟲視網(wǎng)膜炎癥的特異性診斷低于83.0％。WB是一種有效的補充診斷方法，用于新生兒先天性弓形蟲病診斷。如IgA與IgM的ELISA、IgG與IgM的WB兩者結合，分別具有94％、94％和100％的靈敏度［30］。

3.10親和力試驗 寄生蟲感染后產(chǎn)生抗弓形蟲IgG，不能確定感染具體時間，抗弓形蟲IgM抗體不能作為急性感染的精確標準，IgA也不能作為急性階段的特異性標志物。Hedman等［31］描述的IgG親和力試驗被廣泛應用于鑒別急性和慢性弓形蟲感染。弓形蟲抗原的特異性抗體的親和力在不同感染時期有所不同。在早期感染時，親和力隨感染病程而上升，因此可用于區(qū)分慢性和急性感染。該試驗適合于不同的血清學試驗過程中檢測IgG、IgM和IgA，但具有一定限制性，如妊娠婦女檢測弓形蟲特異性IgG親和力較低，可能與懷孕期間對弓形蟲的治療有關［32］。

4　基于檢測寄生蟲核酸的分子生物學診斷

分子生物學診斷通常作為血清學檢測弓形蟲病之外的檢測方法，常規(guī)方法雖然正確率較高，但是對產(chǎn)前診斷和免疫缺陷患者的診斷具有一定限制性。如妊娠婦女可能通過血清學確診感染弓形蟲，此時胎兒被感染的潛在幾率增加，但是血清學結果并不能確定寄生蟲是否通過母嬰傳播導致胎兒感染，而分子生物學方法可對胎兒是否感染弓形蟲進行準確診斷。

4.1常規(guī)PCR由于傳統(tǒng)診斷方法的內(nèi)在限制，PCR是除血清學之外診斷弓形蟲病的重要方法之一。PCR可以進行有效體外酶擴增，在較短時間內(nèi)通過微量原料特異性擴增出DNA片段。生物樣本檢測弓形蟲感染常用的拷貝目的基因包括B1基因、529 bp的重復序列、內(nèi)部轉錄間隔序列（ITS-1）和18S rDNA序列。當出現(xiàn)寄生蟲血癥時，對血液樣本進行PCR意義不大，SAG1、SAG2和GRA1等單拷貝基因也可作為PCR的目的基因。

檢測弓形蟲B1基因被廣泛應用于先天性弓形蟲病的產(chǎn)前檢測以及免疫缺陷患者的弓形蟲感染。將529 bp的重復序列擴增10～100次后進行檢測，比單純檢測B1基因更敏感［33-34］。在極少數(shù)實驗中，多拷貝ITS-1和18S rDNA也可以作為靶基因，與B1基因的敏感性相似。巢式PCR針對B1基因、529 bp和ITS-1序列檢測時，建立2個連續(xù)PCR體系所使用的2組不同引物，并且使用第1次PCR的反應產(chǎn)物作為第2次PCR反應模板，其檢測結果與常規(guī)PCR檢測相比較，更具有敏感性和特異性。巢式PCR對529 bp重復片段的檢測極限是640 fg的寄生蟲DNA，對B1基因最小為5.12 pg，巢式PCR對B1基因的靈敏度高于ITS-1［35］。

4.2實時聚合酶鏈反應（real-time PCR，RTPCR） RT-PCR可檢測到低濃度的靶DNA并且定量正在復制的特異性DNA模板，在每個循環(huán)通過探針和嵌合染料可檢測到擴增產(chǎn)物，可通過標準已知濃度進行定量。RT-PCR可對人的血液、腦脊液、羊水、房水及其他樣本檢測，還可用于評估弓形蟲病進程和治療效果，以及弓形蟲感染強度［36-38］。與常規(guī)PCR和巢式PCR相比，RT-PCR檢測B1基因是診斷先天性弓形蟲病表現(xiàn)最好的技術。由于其是一個快速封閉的管狀系統(tǒng)，RT-PCR可消除污染對定量結果的影響，因此適于標準化校準。

Opsteegh等［39］發(fā)明一種磁力捕獲特異性序列的方法，可從不同組織分布的弓形蟲組織包囊這樣的大組織樣本中定位弓形蟲DNA，也可通過微量樣本進行檢測，這項技術結合RT-PCR可用于肉類樣本檢測，評估弓形蟲感染食源性動物的不同組織的干擾因素。

4.3環(huán)介導等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification， LAMP） LAMP是一種特殊的DNA擴增技術，在等溫條件下用4種引物識別靶基因的6個區(qū)域。該法靈敏度略高于常規(guī)PCR，略低于RT-PCR［40］。LAMP可從人類和動物樣本以及水樣本中定位弓形蟲基因如SAG1、29-bp重復序列、B1、SAG2、GRA1、卵囊壁蛋白（oocyst wall protein， OWP）基因和18S rRNA［41］。LAMP可以在感染弓形蟲2 d豬的血液樣本中檢測出弓形蟲DNA，該方法可用于弓形蟲病的早期診斷。B1-LAMP和OWP-LAMP檢測閾值極低，LAMP在人血樣本和水樣本檢測弓形蟲時通常定位SAG1、SAG2和 B1基因。由于LAMP只要求水浴或加熱器，能目測到擴增產(chǎn)物，可在沒有精密復雜的昂貴儀器時做為一種診斷替代方法。但是就目前而言，LAMP似乎極易被污染，因此嚴格的質(zhì)量控制是降低假陽性的基本標準。

5　小　　結

顯微鏡檢查和活體檢查是針對弓形蟲檢查的“金標準”，雖然準確性高，但比較費時費力，不便于大樣本篩查。臨床上更多應用血清學檢測方法檢測弓形蟲特異性抗體或循環(huán)抗原，具有較高的準確性，操作簡便快捷，臨床上經(jīng)常使用，也適用于流行病學調(diào)查。在診斷弓形蟲病的方法中，分子生物學方法最為標準化，也比較客觀，是近年來持續(xù)研究與發(fā)展的熱點。了解弓形蟲基因組、轉錄組和蛋白質(zhì)組學技術和基因及血清學分型法，對調(diào)查弓形蟲的遺傳特性有著至關重要的作用。綜合運用分子生物學和生物技術，可能為診斷弓形蟲病提供全新的思路。

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（2015-11-11收稿 2015-12-28修回）

（責任編委 曲 芬 本文編輯 陳玉琪）

［文獻標志碼］［中國圖書資料分類號］ R531.8 A

［文章編號］1007-8134（2016）03-0139-05

*Corresponding author， E-mail： liuquan1973@hotmail.com

［基金項目］公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303042）

［作者單位 ］130117，長春中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院實驗教學中心（馮嘉軒、吳澤民、劉智），生物教研室（李娜）；130122 長春，軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所病毒學研究室（趙永坤），寄生蟲病研究室 吉林省人畜共患病預防與控制重點實驗室（劉全）；133002，延邊大學醫(yī)學院免疫與病原微生物教研室（孟繁平）

［通訊作者］劉全，E-mail∶ liuquan1973@hotmail.com

Advances in diagnostic techniques of toxoplasmosis

FENG Jia-xuan， ZHAO Yong-kun， MENG Fan-ping， WU Ze-min， LIU Zhi， LI Na， LIU Quan*
Center of Experimental Teaching， College of Basic Medicine， Changchun University of Chinese Medicine， Changchun， Jilin 130117， China

［Abstract］Toxoplasmosis is a severe parasitic zoonosis caused by Toxoplasma gondii， which poses a threat to human health. In this paper， the diagnostic techniques of toxoplasmosis and detection methods of T. gondii were reviewed， including non-DNA-based diagnostic methods， serological assays， and molecular methods based on detection of parasite nucleic acid in hope of providing an insight into the development of novel diagnostic technologies and methods of toxoplasmosis.

［Key words］toxoplasmosis； molecular biology； diagnosis