黃花芥藍(lán)染色體制片優(yōu)化及核型分析

夏 雪，辜金花，劉丹，吳益梅，田玉肖，陳 清，張 芬，湯浩茹，孫 勃

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都611130）

黃花芥藍(lán)染色體制片優(yōu)化及核型分析

夏 雪，辜金花，劉丹，吳益梅，田玉肖，陳 清，張 芬，湯浩茹，孫 勃*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都611130）

以黃花芥藍(lán)典型品種“福州黃花”為材料，對影響染色體制片效果的取材時(shí)間點(diǎn)、預(yù)處理時(shí)間和解離時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行核型分析.結(jié)果表明:上午9:00取材，分裂相細(xì)胞和中期分裂相細(xì)胞最多；0.002 mol/L 8-羥基喹啉預(yù)處理5 h染色體收縮性最好，形態(tài)最佳，分散性好；1 mol/L HCl 60℃解離8 min細(xì)胞分散，染色體著色良好而細(xì)胞質(zhì)透明，對比度高.黃花芥藍(lán)的染色體數(shù)目為2n=2x=18，染色體相對長度變化范圍為9.66%～14.29%，染色體長度比為1.48，其染色體類型包括長染色體（large chromosomes，L）、中長染色體（middle chromosomes 2，M2）和中短染色體（middle chromosomes 1，M1），染色體相對長度組成為2L+2M2+14 M1，著絲粒指數(shù)變化范圍為27.86%～48.19%，臂比值變化范圍為1.08～2.59，其中第1、4、6、9對染色體為近中部著絲粒染色體（submetacentric chromosomes，sm），其余5對為中部著絲粒染色體（metacentric chromosomes，m），第6對染色體具有隨體（satellites，SAT），核型不對稱系數(shù)為61.95%，核型分類標(biāo)準(zhǔn)屬2A型.同時(shí)，本研究還比較了黃花芥藍(lán)與已報(bào)道的白花芥藍(lán)的核型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者在核型公式、染色體長度比和相對長度范圍等方面存在明顯差異.研究結(jié)果豐富了對芥藍(lán)遺傳組成的認(rèn)知，為芥藍(lán)分類地位與種內(nèi)親緣關(guān)系研究提供細(xì)胞學(xué)證據(jù).

黃花芥藍(lán)；染色體；制片優(yōu)化；核型分析

SummaryChinese kale（Brassica alboglabra Bailey）is an original Chinese vegetable belonging to the Brassicaceae family of cruciferae.It is commonly grown for its bolting stems and tender rosette leaves as the edible parts，which are tender and crisp.Chinese kale contains large amounts of health-promoting compounds，such as vitamin C，carotenoids，total phenolics，and glucosinolates.It is widely distributed in Guangdong，F(xiàn)ujian and Guangxi Provinces.

The typical yellow-flower Chinese kale cultivar“Fuzhou-Huanghua”was used as the plant material，the ____chromosome staining factors，including sampling time point，pretreatment and dissociation duration，wereoptimized.Karyotype characteristics were also investigated，and then the obtained results were compared with those from the reported white-flower Chinese kale so as to reveal the karyotype differences.

The seeds of“Fuzhou-Huanghua”were soaked for 2 hours，and then cultured in dark in petri dishes with moist filter paper at 25℃for 3 days.The root tips were excised between 8:00—10:00 AM，with 30 min intervals to determine the optimum sampling time point；pretreatment in 0.002 mol/L 8-hydroxyquinoline were conducted for 1- 10 h（1，2.5，5，7.5 and 10 h，respectively），subsequently，the root tips were macerated in 1 mol/L hydrochloric acid at 60℃for 1- 16 min（1，4，8，12 and 16 min，respectively）.Thirty cells with clear metaphase chromosomes were selected，and then the numbers and karyotype analysis of chromosomes were done by the cytological standards.

The results showed that the percentage of the mitotic cells and metaphase cells reached maximum when sampled at 9:00 AM；the best contraction，shape and dispersion of chromosomes were found at 5-h pretreatment with 0.002 mol/L 8-hydroxyquinoline；the best cell dispersion，chromosome staining and cytoplasm transparency，as well as the highest contrast ratio were observed at 8-min dissociation.Yellow-flower Chinese kale has a total of 18 chromosomes.The chromosome types included large chromosomes（L），middle chromosomes 2（M2），middle chromosomes 1（M1），and the constitution of the relative length was 2 L+2M2+14 M1.The centromeric index ranged from 27.86%to 48.19%，and the arm ratio ranked from 1.08 to 2.59.There were four pairs（the first，forth，sixth and ninth chromosome）of submetacentric chromosomes（sm）and five pairs（number two，three，five，seven and eight chromosome）of metacentric chromosomes（m），while the two satellites（SAT）were observed at the sixth pair of chromosomes.The karyotype formula was 2n=2x=18=10m+8sm（2SAT）.Karyotype asymmetry index（As.K）was 61.95%，and karyotype characteristics fell into type 2A according to STEBBINS classification criteria.Meanwhile，significant differences in karyotype formula，ratio of chromosome length（L/S），and range of chromosome relative length were observed when comparing the chromosome characteristics between yellow-flower and the reported white-flower Chinese kale.Specifically，compared with the above results，four m and five sm chromosomes were reported in six white-flower cultivars.Moreover，the ratio of chromosome length（L/S）in yellow-flower Chinese kale（1.48）was lower than that in white-flower Chinese kale cultivars（1.50- 1.71），which is mainly due to the fact that the shortest chromosome relative length in yellow-flower Chinese kale（9.66%）was obviously higher than that in white-flower ones.However，no significant difference was observed in arm ratio range，As.K or satellite position between the two types.

In conclusion，the optimized chromosome preparation conditions and karyotype analysis of yellow-flower Chinese kale were revealed.These results will enrich the awareness of genetic composition of Chinese kale，and provide cytological evidence for the study on the taxonomic status and phylogenetic relationship of these taxa.

芥藍(lán)（Brassica alboglabra Bailey）起源于中國的十字花科蕓薹屬蔬菜，主要以肥嫩的花薹及其嫩葉作為食用部分，其質(zhì)地脆嫩，營養(yǎng)豐富，含有維生素C、類胡蘿卜素、多酚和芥子油苷等多種營養(yǎng)成分［13］，主要分布在我國廣東、福建和廣西等省區(qū). BAILEY［4］對獲得的白花芥藍(lán)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)與其他甘藍(lán)類植物花色為黃色不同，據(jù)此將芥藍(lán)定為一個(gè)種.后來的研究人員從雜交親和性、同工酶、染色體核型等多個(gè)角度進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，從而形成了關(guān)于芥藍(lán)與甘藍(lán)分類關(guān)系的2種觀點(diǎn)，一種認(rèn)為芥藍(lán)是獨(dú)立于甘藍(lán)的種［45］，另一種認(rèn)為芥藍(lán)屬于甘藍(lán)的變種［69］.

除白花芥藍(lán)外，黃花芥藍(lán)也是芥藍(lán)的一種重要類型，2種類型在花色、產(chǎn)地、生物學(xué)特性和營養(yǎng)品質(zhì)等方面存在顯著差異［2，10］，但關(guān)于兩者關(guān)系的研究還鮮有報(bào)道.核型分析作為一種重要的細(xì)胞學(xué)研究手段，廣泛地應(yīng)用于物種發(fā)育進(jìn)化及物種間親緣關(guān)系的研究中［1112］.截至目前，研究人員對多個(gè)白花芥藍(lán)品種的核型進(jìn)行了分析［6，9，1314］，但關(guān)于黃花芥藍(lán)的核型還尚未見報(bào)道.本試驗(yàn)以黃花芥藍(lán)典型品種為材料，首先對其染色體制片的關(guān)鍵步驟進(jìn)行條件優(yōu)化，之后采用最佳制片條件進(jìn)行黃花芥藍(lán)的核型分析，并與已報(bào)道的白花芥藍(lán)核型結(jié)果進(jìn)行比較，進(jìn)而揭示黃花芥藍(lán)與白花芥藍(lán)的染色體核型差異，以期為芥藍(lán)分類地位與種內(nèi)親緣關(guān)系研究提供細(xì)胞學(xué)證據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

供試芥藍(lán)為產(chǎn)自福建的典型黃花品種“福州黃花”（Brassica alboglabra cv.Fuzhou-Huanghua）.

1.2 方法

本試驗(yàn)于2014年9—11月間在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行.以黃花芥藍(lán)根尖為材料，挑選籽粒飽滿的黃花芥藍(lán)種子在室溫下浸種2 h，之后放入鋪有雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中25℃恒溫暗培養(yǎng)3 d，當(dāng)根尖長度至10～15 mm時(shí)，每30 min為1個(gè)時(shí)間間隔，剪取上午8:00—10:00的芥藍(lán)根尖，以確定最適的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材；4℃條件下以0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液分別預(yù)處理1 h、2.5 h、5 h、7.5 h和10 h，以確定最優(yōu)預(yù)處理時(shí)間.將預(yù)處理好的材料置于卡諾固定液（冰醋酸∶無水乙醇=1∶3）4℃固定24 h，之后分別用95%、85%和75%的乙醇溶液梯度洗脫，最后保存在75%的乙醇溶液中.解離采用酸解法，將保存好的根尖用1 mol/L HCl 60℃下分別解離1 min、4 min、8 min、12 min和16 min，以確定最優(yōu)解離時(shí)間.之后用蒸餾水清洗3次，切取黃花芥藍(lán)根尖分生區(qū)部分于載玻片上，卡寶品紅染液染色5～10 min，常規(guī)壓片后鏡檢，將裝片中染色體形態(tài)及分散良好的中期分裂相細(xì)胞在Olympus CX21顯微鏡100倍油鏡下觀察并拍照.

選取30個(gè)染色體數(shù)目清晰的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，核型分析采用李懋學(xué)，等［11］提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，確定著絲粒位置，根據(jù)染色體的大小和形態(tài)特征對染色體核型進(jìn)行配對分析，染色體的相對長度、臂比及類型按照LEVAN，等［15］的命名法則計(jì)算，著絲粒指數(shù)和染色體相對長度系數(shù)參照李懋學(xué)，等［11］的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，核型不對稱系數(shù)采用ARANO［16］方法計(jì)算，核型類型按照STEBBINS［17］的標(biāo)準(zhǔn)劃分.

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體制片的優(yōu)化

2.1.1 取材時(shí)間點(diǎn)對分裂相細(xì)胞數(shù)的影響

我們對不同取材時(shí)間點(diǎn)黃花芥藍(lán)根尖分裂相細(xì)胞數(shù)和中期分裂相細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了計(jì)數(shù)與統(tǒng)計(jì).由圖1可見，不同取材時(shí)間點(diǎn)分裂相細(xì)胞百分比和中期分裂相細(xì)胞百分比存在顯著差異.上午9:00取材的分裂相細(xì)胞百分比高達(dá)52.16%，顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)，其次是上午9:30，分裂相比例也超過40%，而上午10:00、8:30和8:00間比例最低且無顯著差異，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均不足上午9:00的一半.中期分裂相細(xì)胞百分比統(tǒng)計(jì)結(jié)果與分裂相細(xì)胞百分比結(jié)果趨勢基本一致，上午9:00比例最高，為2.51%.綜合分裂相和中期分裂相細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果，上午9:00取材可以觀察到的分裂相和中期分裂相細(xì)胞最多，最易篩選出分散良好的染色體分裂相.因此，上午9:00是觀察黃花芥藍(lán)染色體的最佳取材時(shí)間點(diǎn)，后續(xù)的研究也均采用該時(shí)間點(diǎn)作為取材時(shí)刻.

圖1 黃花芥藍(lán)不同取材時(shí)間點(diǎn)分裂相細(xì)胞和中期分裂相細(xì)胞的百分比Fig.1 Percentage of cells at the mitotic and metaphase stage in yellow-flower Chinese kale under different sampling time points

2.1.2 預(yù)處理時(shí)間對制片效果的影響

不同預(yù)處理時(shí)間（解離時(shí)間為8 min）對黃花芥藍(lán)染色體制片效果存在明顯影響.結(jié)果（圖2）表明，預(yù)處理1 h，染色體固縮程度明顯不足，且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，同時(shí)染色體聚為一團(tuán)，分散性差（圖2A）；預(yù)處理2.5 h，染色體分散程度略有改善，但仍不理想，同時(shí)染色體形態(tài)不佳，多呈長棒狀，著絲粒不明顯（圖2B）；預(yù)處理5 h，染色體收縮性最好，形態(tài)最佳，均呈現(xiàn)“X”型，著絲粒清晰可見，同時(shí)分散性很好（圖2C）；預(yù)處理7.5 h，染色體分散性好，但部分染色體收縮過度呈點(diǎn)狀，已不適合用于核型分析（圖2D）；預(yù)處理10 h，染色體最為分散，但大多染色體都收縮過度，著絲粒不明顯，只適合染色體計(jì)數(shù)（圖2E）.綜上，預(yù)處理5 h的染色體最適合用于黃花芥藍(lán)染色體的核型分析.

圖2 不同預(yù)處理時(shí)間處理后的黃花芥藍(lán)染色體圖Fig.2 Chromosomes of yellow-flower Chinese kale under different pretreatment time

2.1.3 解離時(shí)間對制片效果的影響

不同解離時(shí)間對黃花芥藍(lán)染色體制片效果也存在明顯的影響.在60℃下1 mol/L HCl解離8 min，細(xì)胞間較為分散，染色體著色良好而細(xì)胞質(zhì)趨于透明，對比度高，解離效果最佳（圖3C）；解離1 min和4 min，解離不夠充分，細(xì)胞不易分散，細(xì)胞內(nèi)部的染色體也很難分散，外部細(xì)胞染色體和細(xì)胞質(zhì)均著色很深，對比度低，而內(nèi)部細(xì)胞由于接觸不到染液而無法著色，導(dǎo)致染色體不易進(jìn)行觀察和分析（圖3A，B）；當(dāng)解離12 min和16 min，解離程度逐漸過度，雖然細(xì)胞比較分散且細(xì)胞質(zhì)不被染色，但細(xì)胞中的染色體同樣也不易著色，從而導(dǎo)致染色體顏色太淺，不易進(jìn)行后續(xù)的觀察和分析（圖3D，E）.因此，我們選擇8 min作為后續(xù)試驗(yàn)的解離時(shí)間.

圖3 不同解離時(shí)間處理后的黃花芥藍(lán)染色體圖Fig.3 Chromosomes of yellow-flower Chinese kale under different dissociation time

2.2 核型分析

選擇30個(gè)染色體分散良好的細(xì)胞進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，結(jié)果表明所有細(xì)胞的染色體均為18條，占計(jì)數(shù)細(xì)胞的100%，從而確定黃花芥藍(lán)的染色體數(shù)目為2n=2x=18.圖4顯示黃花芥藍(lán)各染色體清晰可見，均呈“X”型，且著絲粒明顯，其中2條染色體具有隨體.核型分析的結(jié)果見表1，黃花芥藍(lán)染色體絕對長度變化范圍為3.92～5.80μm，平均絕對長度為4.51μm，染色體相對長度變化范圍為9.66%～14.29%；染色體相對長度系數(shù)變化范圍為0.87～1.29，其染色體相對長度組成為2L+2M2+14M1，其中L、M2和M1分別代表長染色體（large chromosomes）、中長染色體（middle chromosomes 2）和中短染色體（middle chromosomes 1）；著絲粒指數(shù)變化范圍為27.86%～48.19%，臂比值變化范圍為1.08～2.59，其中第1、4、6、9對染色體為近中部著絲粒染色體（submetacentric chromosomes，sm），其余5對為中部著絲粒染色體（metacentric chromosomes，m），第6對染色體具有隨體.核型公式為2n=2x= 18=10m+8sm（2SAT），其中SAT代表隨體（satellites），染色體長度比為1.48，臂比值大于2∶1的染色體占總?cè)旧w的33.33%，根據(jù)STEBBINS的核型分類標(biāo)準(zhǔn)，黃花芥藍(lán)的核型屬2A型，核型不對稱系數(shù)為61.95%.其核型模式圖如圖5所示.

表1 黃花芥藍(lán)染色體核型參數(shù)Table1 Karyotype parameters of chromosome of yellow-flower Chinese kale

圖4 黃花芥藍(lán)根尖染色體中期分裂相與核型圖Fig.4 Metaphase chromosomes and karyotype of yellow-flower Chinese kale root tips

3 討論

圖5 黃花芥藍(lán)染色體核型模式圖Fig.5 Chromosome idiogram of yellow-flower Chinese kale

甘藍(lán)類蔬菜的染色體多為小染色體類型，且相鄰染色體形態(tài)又非常相似［18］，因此本試驗(yàn)首先針對取材時(shí)間點(diǎn)、預(yù)處理時(shí)間和解離時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化，篩選到了黃花芥藍(lán)的最佳染色體制片條件.植物旺盛分裂期一般出現(xiàn)在上午期間，為獲得更多的分裂相，研究人員通常將取材時(shí)間點(diǎn)設(shè)在上午，如黃瓜在上午8:40—9:10取材最佳［19］，百里香在上午9:00取材最佳［20］，本試驗(yàn)中黃花芥藍(lán)的最佳取材時(shí)間點(diǎn)為上午9:00，與黃瓜和百里香等植物基本相同.但不同物種的細(xì)胞分裂旺盛期存在一定差異，如甜瓜和玉米等在上午8:00取材最佳［2122］.通過預(yù)處理環(huán)節(jié)可以獲得更多的中期分裂相細(xì)胞；同時(shí)還能改變細(xì)胞質(zhì)的黏度，促使染色體收縮與分散，因此，預(yù)處理是染色體制片過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié).不同預(yù)處理溶液作用有所不同，研究表明8-羥基喹啉處理能使染色體及縊痕顯示清晰，通常適合染色體較大的植物［23］，但在不同植物中效果可能會(huì)有所不同.甘藍(lán)類蔬菜的染色體一般較小，張紅梅，等［18］對青花菜進(jìn)行條件優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，相比秋水仙素、對二氯苯和冰水等預(yù)處理溶液，8-羥基喹啉處理2.5 h效果最好，其他研究人員進(jìn)行包括白花芥藍(lán)在內(nèi)的甘藍(lán)類蔬菜核型分析時(shí)也多采用8-羥基喹啉進(jìn)行預(yù)處理2～2.5 h［9，1314］.因此本研究也采用8-羥基喹啉進(jìn)行處理并對預(yù)處理時(shí)間進(jìn)行了分析，結(jié)果表明5 h效果最佳，造成時(shí)間差異的原因可能是由于物種不同導(dǎo)致的.迄今為止，黃花芥藍(lán)的核型分析尚未見報(bào)道，作為芥藍(lán)的一個(gè)重要類型，其最佳預(yù)處理時(shí)間可能與白花芥藍(lán)及其他甘藍(lán)類蔬菜有所不同.解離也是影響制片效果的一項(xiàng)重要因素，其目的是分解和軟化細(xì)胞壁，使細(xì)胞間易于分離，同時(shí)清除部分細(xì)胞質(zhì)，使細(xì)胞質(zhì)背景透明化，便于染色體的觀察.本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，解離時(shí)間短，壓片時(shí)細(xì)胞不易分散，細(xì)胞染色體和細(xì)胞質(zhì)著色對比度低，不易觀察；解離時(shí)間過長，則較難染色，這與前人的研究結(jié)果一致［20，24］.

黃花芥藍(lán)與白花芥藍(lán)作為芥藍(lán)的2種重要類型，在表型、農(nóng)藝性狀、營養(yǎng)品質(zhì)等方面存在明顯差異［2，10］，本試驗(yàn)對黃花芥藍(lán)典型品種“福州黃花”的核型進(jìn)行了分析，同時(shí)對4篇文獻(xiàn)中6個(gè)品種的白花芥藍(lán)核型進(jìn)行歸納整理［6，9，1314］，之后對黃花芥藍(lán)與白花芥藍(lán)的核型差異進(jìn)行了比較（表2）.結(jié)果表明，黃花芥藍(lán)與白花芥藍(lán)在核型公式、染色體長度比和相對長度范圍等方面存在明顯差異，這些差異可能與表型差異有關(guān).已報(bào)道的6個(gè)白花芥藍(lán)品種單套染色體組中均有4條中部著絲粒染色體（m）和5條近中部著絲粒染色體（sm），而黃花芥藍(lán)正好相反；白花芥藍(lán)的染色體長度比范圍為1.50～1.71，均明顯高于黃花芥藍(lán)，這主要是由于黃花芥藍(lán)的最短染色體相對長度（9.66%）明顯高于白花芥藍(lán)（8.05%～9.16%），而黃花芥藍(lán)的臂比值范圍和核型不對稱系數(shù)與白花芥藍(lán)無明顯差異.通常同一種中的隨體數(shù)量和位置是相對穩(wěn)定的，但同一種的不同變種、不同類型及不同品種間其隨體的數(shù)目、位置和形態(tài)等可能存在不同程度的變異.研究表明，6個(gè)白花芥藍(lán)品種均為1對隨體，但所處位置在第5、6、7對染色體上均有報(bào)道［6，9，1314］.本試驗(yàn)中黃花芥藍(lán)與白花芥藍(lán)一樣，僅有1對隨體，隨體位于第6對染色體上.甘藍(lán)類蔬菜在世界各地廣泛栽培，具有很強(qiáng)的遺傳多樣性，而地理環(huán)境及人工選擇因素可能導(dǎo)致其不同變種、不同類型及不同品種在遺傳組成及核型方面形成較大差異［9］，這可能也是黃花芥藍(lán)與白花芥藍(lán)核型存在差異的主要原因.同時(shí)我們也會(huì)在今后的研究中分析更多品種的黃花芥藍(lán)，以便更為準(zhǔn)確地反映黃花芥藍(lán)與白花芥藍(lán)的核型差異.

表2 黃花芥藍(lán)與已報(bào)道的白花芥藍(lán)核型差異比較Table2 Differences of chromosome karyotype between yellow-flower Chinese kale and reported white-flower Chinese kale

本試驗(yàn)對“福州黃花”芥藍(lán)的染色體制片條件進(jìn)行了優(yōu)化，取材最佳時(shí)間點(diǎn)為上午9:00，0.002 mol/L 8-羥基喹啉預(yù)處理最佳時(shí)間為5 h，1 mol/L HCl 60℃解離最佳時(shí)間為8 min，條件優(yōu)化結(jié)果為黃花芥藍(lán)的核型分析、原位雜交及分子標(biāo)記等研究提供了基礎(chǔ).同時(shí)本試驗(yàn)還揭示了黃花芥藍(lán)的核型特征，并與已報(bào)道的白花芥藍(lán)核型進(jìn)行比較，從染色體水平上分析了黃花芥藍(lán)與白花芥藍(lán)的差異，豐富了人們對芥藍(lán)遺傳組成的認(rèn)知，為芥藍(lán)分類地位、種的進(jìn)化、種內(nèi)親緣關(guān)系、遺傳多樣性研究及育種工作提供了參考.

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XIA Xue，GU Jinhua，LIU Dan，WU Yimei，TIAN Yuxiao，CHEN Qing，ZHANG Fen，TANG Haoru，SUN Bo*
（College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）

yellow-flower Chinese kale；chromosome；preparation optimization；karyotype analysis

Q 243；S 635

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2015.06.061

國家自然科學(xué)基金（31500247）；四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（14ZA0016）；四川省省級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410626036；201510626060）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)本科質(zhì)量工程項(xiàng)目（04052109）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)本科教學(xué)改革研究項(xiàng)目（X2015020）.

*通信作者（Corresponding author）:孫勃（http://orcid.org/0000-0003-3306-656X），Tel:+86- 835- 2882293，E-mail:14099@sicau. edu.cn

聯(lián)系方式:夏雪（http://orcid.org/0000-0003-0617-8419），E-mail:1033587510@qq.com

（Received）:2015- 06- 06；接受日期（Accepted）:2015- 11- 19；

日期（Published online）:2016- 09- 18

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160918.1609.026.html