傷科消腫顆粒處方提取工藝優(yōu)選*

李海英，劉 武，劉吉成

（1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023； 2．廣西壯族自治區(qū)玉林食品藥品檢驗所，廣西 玉林 537000）

傷科消腫顆粒處方提取工藝優(yōu)選*

李海英1，劉 武1，劉吉成2

（1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023； 2．廣西壯族自治區(qū)玉林食品藥品檢驗所，廣西 玉林 537000）

目的 優(yōu)選傷科消腫顆粒的提取工藝條件。方法 以揮發(fā)油的提取量、干膏量、芍藥苷和綠原酸含量為綜合指標，采用正交試驗優(yōu)選最佳提取條件。結(jié)果 先取薄荷用水提取，揮發(fā)油提取率為75．3%；再取薄荷藥渣及藥液與其他14味藥材，加水煎煮2次，芍藥苷和綠原酸提取率為79．8%和83．3%；干膏量為每張?zhí)幏?6．49 g；濃縮水提液至相對密度1．15，加乙醇至60%（g／g），冷藏靜置12 h，減壓濃縮上清液，芍藥苷和綠原酸的轉(zhuǎn)移保留率為80%和74%，干膏量為每張?zhí)幏?0．01 g。結(jié)論 優(yōu)選的提取工藝簡單、穩(wěn)定、可行，為傷科消腫顆粒處方提取工藝條件提供了科學(xué)依據(jù)。

傷科消腫顆粒；正交試驗；提取工藝

傷科消腫顆粒是在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗處方基礎(chǔ)上生產(chǎn)的顆粒劑型醫(yī)院制劑，主要由土鱉蟲、赤芍、澤蘭、金銀花、粉防己、連翹等15味中藥材經(jīng)提取加工等步驟制成，具有活血止痛、利水消腫之功效[1－2]，臨床主要用于外傷或車禍患者骨折術(shù)。中藥顆粒劑給藥方便，既可吞服又可混懸或溶解在水中服用，且吸收好、起效快、不良反應(yīng)小、攜帶方便[3]。本試驗中是在臨床應(yīng)用的經(jīng)驗處方基礎(chǔ)上[1－2]，對方中有效成分進行提取、純化而制成醫(yī)院制劑，以在療效、成本、不良反應(yīng)、患者服藥順應(yīng)性等諸多方面綜合衡量，對此方進一步優(yōu)化成顆粒劑，研制新的中成藥制劑，為更好地發(fā)揮傷科消腫顆粒療效提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜議（美國安捷倫科技有限公司，配DAD檢測器）；Millipore Simplicity－UV型超純水機(美國密里博公司)；SB2200－T型超聲波清洗器（上海必能信公司）；BZF－30型電熱真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠）；RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；BT224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；MA100型水分測定儀（中國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；CP225D1／10萬電子天平（中國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；GM－0．33Ⅱ隔膜真空泵（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）；SHB－Ⅱ循環(huán)式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)易有限公司）；OS101－2AB型電熱干燥箱（重慶銀河試驗儀器有限公司）。乙醇（分析純）、乙腈（色譜純）、磷酸（分析純），均購自西隴化工股份有限公司；淀粉、糊精、蔗糖、乳糖為輔料。芍藥苷對照品（批號為 110736－201337，含量94．9%），綠原酸對照品（批號為110753～201314，含量96．6%），均由中國食品藥品檢定研究院提供。試驗所用各藥材購于廣西玉林中藥材市場，經(jīng)廣西玉林食品藥品檢驗所中藥室劉吉成鑒定為正品，詳見表1。

表1 傷科消腫顆粒中15味中藥材一覽表

2 方法與結(jié)果

2．1 指標成分的測定

傷科消腫顆粒方中薄荷需單獨提取，故以揮發(fā)油收集量作為薄荷提取的考察指標；赤芍和金銀花中的主要有效成分別為芍藥苷和綠原酸[4]，與本方的功能主治有一定相關(guān)性，故將芍藥苷和綠原酸作為傷科消腫顆粒提取工藝篩選時含量測定的指標性成分。為更有效地提取傷科消腫顆粒中的成分，另將與本方中藥材提取得到的干膏量作為工藝篩選指標。各指標成分檢測方法為芍藥苷和綠原酸，用高效液相色譜（HPLC）法測量，波長分別為230 nm和327 nm；揮發(fā)油和干膏用重量法測量。

2．2 含量測定方法學(xué)考察

色譜條件：色譜柱為菲羅門Gemini C18柱(250 mm× 4．6 mm，5 μm)；流動相為乙腈－0．1%磷酸溶液（14∶86）；流速為1．0 mL／min；柱溫為30℃；檢測波長芍藥苷為230 nm，綠原酸為327 nm；進樣量為10 μL。在此條件下，理論板數(shù)以芍藥苷峰計算應(yīng)不低于3 000。芍藥苷在進樣溶液質(zhì)量濃度為2．754～275．4 μg／mL時，與峰面積線性關(guān)系為 Y＝10．93 X＋7．795（r＝0．999 4），平均回收率為98．3%，RSD為1．4%；綠原酸進樣溶液質(zhì)量濃度為4．343～434．3 μg／mL時與峰面積線性關(guān)系為 Y＝20．55 X－5．15（r＝0．999 6），平均回收率為111．4%，RSD為2．6%。

2．3 提取工藝正交試驗

2．3．1 揮發(fā)油提取預(yù)試驗

處方中薄荷的揮發(fā)油為藥理活性成分之一，屬輕質(zhì)油。稱取薄荷100 g，加入藥材8倍量水，浸泡20 min，水蒸氣蒸餾至揮發(fā)油的量不再增加，記錄各時間點揮發(fā)油的收集量。結(jié)果提取0．5，1，1．5，2，2．5，3 h時揮發(fā)油收集量分別為0．3，0．5，0．67，0．75，0．76，0．76 mL，結(jié)果表明，在2．5 h以后油收集量變化不大，故選擇1．5，2，2．5 h為考察提取時間的3個水平。

2．3．2 揮發(fā)油提取正交試驗優(yōu)選

浸泡時間：稱取薄荷藥材3份每份100 g，分別加水浸泡20，30，40 min，用水蒸氣蒸餾，測量揮發(fā)油的收集量。

加水量：稱取薄荷藥材3份，每份100 g，分別加6，8，10倍水浸泡，用水蒸氣蒸餾，測量揮發(fā)油的收集量。

以浸泡時間（A）、加水量（B）、煎煮時間（C）作為揮發(fā)油提取正交試驗的考察因素，每個因素取3個水平。采用 L9（34）正交試驗法進行試驗，優(yōu)選揮發(fā)油的最佳提取工藝。正交試驗水平因素見表2。

2．3．3 水提工藝正交試驗優(yōu)選

提取時間：取薄荷藥渣及藥液與土鱉蟲、赤芍、金銀花、益母草等其他14味藥材3份煎煮提取，分別提取2，3，4 h，濾過，以干膏重、芍藥苷含量、綠原酸含量綜合評價分析作為考察指標，優(yōu)選最佳水提取工藝。

表2 揮發(fā)油提取因素水平表

提取次數(shù)：取薄荷藥渣及藥液與土鱉蟲、赤芍、金銀花、益母草等其他14味藥材3份煎煮提取，分別提取1，2，3次，濾過，以干膏重、芍藥苷含量、綠原酸含量綜合評價分析作為考察指標，優(yōu)選最佳水提取工藝。

加水量：取薄荷藥渣及藥液與土鱉蟲、赤芍、金銀花、益母草等其他14味藥材3份煎煮提取，分別加6，8，10倍水，濾過，以干膏量、芍藥苷含量、綠原酸含量綜合評價分析作為考察指標，優(yōu)選最佳水提取工藝。

本方臨床使用均為水提取，根據(jù)一般水提取以提取時間（A）、提取次數(shù)（B）、加水量（C）作為考察因素，本方輕質(zhì)和重質(zhì)藥材各半，吸水率較大的藥材粉防己、茯苓等占20%左右，故選擇加水量6，8，10倍。每個因素取3個水平，采用 L9（34）正交試驗法安排試驗，以干膏重、芍藥苷含量、綠原酸含量綜合評價分析作為考察指標，優(yōu)選最佳水提取工藝。正交試驗水平因素表見表3。

表3 水提試驗因素水平表

2．3．4 醇沉工藝正交試驗

相對密度：取水提液分別濃縮相對密度至1．10，1．15，1．20，再用一定濃度的乙醇醇沉，靜置一定時間后以固體減少率、芍藥苷和綠原酸的含量綜合評價分析作為考察指標，優(yōu)選最佳醇沉工藝。

醇沉濃度：分別取濃縮至一定密度的提取液3份，再分別用50%，60%，70%乙醇醇沉，靜置一定時間后以固體減少率、芍藥苷和綠原酸的含量綜合評價分析作為考察指標，優(yōu)選最佳醇沉工藝。

醇沉濃度：分別取濃縮至一定密度的提取液3份，再用一定濃度的乙醇醇沉，分別靜置12，24，48 h后以固體減少率、芍藥苷和綠原酸的含量綜合評價分析作為考察指標，優(yōu)選最佳醇沉工藝。

水提時藥材所含鞣制、淀粉等無效成分溶出，為了進一步去除無效成分，改善制劑狀況減少服用量，保證制劑的溶化性，加入一定量乙醇，使提取液達到適當乙醇濃度來除去雜質(zhì)，對醇沉的工藝條件進行篩選，考察濃縮相對密度（A）、醇沉濃度（B）、醇沉?xí)r間（C）因素。濃縮液1．05時過稀量大，不利于沉淀出無效成分且需要大量乙醇增加生產(chǎn)成本，濃縮液1．25時過稠且加入乙醇后總體積小，沉淀易被濃縮液包裹，不易過濾造成濃縮液殘留在沉淀物中，故濃縮液相對密度考察選擇1．10，1．15，1．20。醇沉濃度也是根據(jù)一般制備顆粒劑的醇沉濃度50%～70%，故選取50%，60%，70%濃度的乙醇醇沉。每個因素取3個水平，采用 L9（34）正交試驗法安排進行試驗，以固體減少率、芍藥苷和綠原酸的含量綜合評價分析作為考察指標，優(yōu)選最佳醇沉工藝。正交試驗水平因素表見表4。

表4 醇沉試驗因素表

2．4 供試品溶液的制備與測定

揮發(fā)油樣品的制備及測定：稱取100 g薄荷藥材9份，分別置揮發(fā)油提取器中，按各揮發(fā)油提取工藝制備，分別記錄各工藝的揮發(fā)油收集量。

水提取樣品的制備及測定：稱取9份單個處方量的薄荷藥材備用，將薄荷按揮發(fā)油項下提取揮發(fā)油后，藥渣及藥液與其他土鱉蟲、赤芍、金銀花、益母草等其他14味藥材合并，按水提工藝制備，得到提取液濃縮，干燥記錄干膏重，然后取干膏約0．5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，過濾，取續(xù)濾液用0．45 μm微孔濾膜過濾。精密吸取供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測定并采用外標一點法計算芍藥苷和綠原酸的含量。

醇提取樣品的制備及測定：取已得到的濃縮液，按各醇沉工藝制備，得到醇沉液濃縮，干燥記錄干膏重，然后取干膏約0．5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，過濾，取續(xù)濾液用0．45 μm微孔濾膜過濾。精密吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定并采用外標一點法計算芍藥苷和綠原酸的提取率。測定結(jié)果見表5至表10。

以揮發(fā)油得量為評價指標，通過上述揮發(fā)油提取正交試驗及方差分析，結(jié)果表明，浸泡時間（因素A）無差異 FA＜F1－0．10（2，2），從生產(chǎn)周期方面考慮，選 A1，即浸泡時間為20 min；加水量（因素B）有差異，F(xiàn)1－0．10（2，2）＜FB＜F1－0．05（2，2），應(yīng)選B3水平，但從極差上看，B2和B3接近，故選B2，即加8倍量水；提取時間（因素C），有顯著性差異 F1－0．05（2，2）＜FC＜F1－0．01（2，2），應(yīng)選 C3即提取2．5 h，最優(yōu)組合確定為A1B2C3，即加入8倍量水，浸泡20 min，水蒸汽蒸餾保持微沸提取2．5 h。

通過考察干膏得量、芍藥苷、綠原酸3個指標，權(quán)重法計算所得綜合評分為評價指標，正交試驗方差分析結(jié)果表明，提取時間（因素A）無差異 FA＜F1－0．10（2，2），從直觀結(jié)果和生產(chǎn)周期方面考慮，選 A1，即提取時間為 2 h；提取次數(shù)（因素 B）有差異 F1－0．10（2，2）＜FB＜F1－0．05（2，2），應(yīng)選 B3水平，但從極差上看，B2和 B3接近，故選B2，即提取2次；加水量（因素C），有顯著性差異 F1－0．05（2，2）＜FC＜F1－0．01（2，2），應(yīng)選 C3，即加水量為10倍量，最優(yōu)組合確定為A1B2C3，即加10倍量水煎煮2次，每次2 h。

表5 揮發(fā)油提取工藝正交設(shè)計及指標測定結(jié)果

表6 揮發(fā)油提取工藝正交試驗方差分析表

表8 綜合評分的方差分析

表9 醇沉工藝正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

表10 綜合評分的方差分析

通過考察固體減少率、芍藥苷、綠原酸3個指標，權(quán)重法計算所得綜合評分為評價指標，正交試驗方差分析結(jié)果表明，濃縮相對密度（因素A）有差異 F1－0．10（2，2）＜FA＜F1－0．05（2，2），應(yīng)選A1水平，考慮相對密度A1清膏量大醇沉需使用較大量的乙醇，后續(xù)濃縮耗能也大，從經(jīng)濟角度出發(fā)權(quán)衡利弊選擇A2，即濃縮相對密度為1．15；醇沉濃度（因素B），有顯著性差異 F1－0．05（2，2）＜FB＜F1－0．01（2，2），從直觀結(jié)果上分析，B1和B2很接近，結(jié)合生產(chǎn)經(jīng)驗，醇沉濃度60%的澄清度會明顯比50%的好，故選擇B2，即醇沉濃度為60%；靜置時間（因素C）無差異 FC＜F1－0．10（2，2），從直觀結(jié)果和生產(chǎn)周期成本考慮，選 C1，即靜置時間為 12 h。理論上最優(yōu)組合為A1B1C1，結(jié)合實際考慮確定最優(yōu)組合A2B2C。即取濃縮至約1．15（80℃）的清膏，加乙醇使含醇量為60%（g／g），順同一方向充分攪拌后冷藏靜置12 h。

2．5 優(yōu)選工藝驗證試驗

按上述確定的最佳揮發(fā)油、水提、醇沉試驗條件分別平行提取3份，計算得到揮發(fā)油提取率為75．3%，RSD為0．77%(n＝3)，水提取的芍藥苷、綠原酸提取率為79．8%，83．3%，干膏量為每張?zhí)幏?6．49 g，RSD分別為3．71%，2．90%，1．16%(n＝3)，醇沉后的芍藥苷轉(zhuǎn)移保留率為80%，綠原酸轉(zhuǎn)移保留率為74%，固體減少率為43．37%，干膏量為每張?zhí)幏?0．01 g，RSD分別為1．95%，3．16%，1．93%，1．76%(n＝3)，表明該工藝合理、穩(wěn)定、可行。

3 討論

在劑型選擇方面，參照文獻可選擇注射劑、膠囊、膏藥、酊劑等劑型，但考慮到中藥注射劑輸液反應(yīng)多[5－6]，生物制劑藥物研發(fā)的新興領(lǐng)域，研發(fā)周期長、失敗率較高[7]。因毒膠囊猖獗市場，貼劑、酊劑等存在刺激性大、吸收慢且污染衣物等缺點，最終選擇可吞服又可混懸或溶解在水中服用、吸收好、起效快、不良反應(yīng)小、攜帶方便的顆粒劑。薄荷揮發(fā)油提取時蒸餾要控制微沸狀態(tài)，否則沸騰過猛形成的油珠不易聚集，且部分揮發(fā)油可能會逸出，影響讀數(shù)的準確性，故在提取時需控制蒸餾溫度。根據(jù)原方湯劑采用水提可以提取出有效藥效成分，由于水提后干膏得量約每張?zhí)幏?6．5 g，若直接干燥制粒則單方服用量太大，考慮方中金銀花、澤蘭、茯苓、粉防己等藥材所含淀粉等無效成分溶出，為了進一步去除無效成分，改善制劑狀況減少服用量，保證制劑的溶化性進行醇沉除雜，在醇沉工藝研究過程中發(fā)現(xiàn)，乙醇應(yīng)邊攪拌邊緩緩加入，否則提取液局部濃度過高，會快速出現(xiàn)蓬松的絮狀沉淀并包裹部分提取液，給過濾帶來困難，并影響醇沉效果。處方中藥物提取的干膏量越多表明提取效率越好，在醇沉中干膏量越少表明提取醇沉出的雜質(zhì)越多。

[1]劉 武，米 琨，王 斌，等．活血利水法治療四肢骨折術(shù)后腫脹療效觀察[J]．新中醫(yī)雜志，2011，43(9):59．

[2]劉 武，米 琨，伏春華，等．活血利水法治療骨折術(shù)后肢體腫脹 320例的臨床回顧性研究[J]．廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，14(3):18．

[3]陶 晶．淺談中草藥制成顆粒劑的優(yōu)點[J]．中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(17):183．

[4]陸小華，馬 驍，王 建，等．赤芍的化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J]．中草藥，2015，46（4）:595－596．

[5]丁 紅，趙俊蘋．淺談中藥注射劑的不良反應(yīng)發(fā)生原因[J]．醫(yī)藥與保健，2014，17（1）:128－129．

[6]陳婉玲，李宇清，楊肖敏，等．49例中藥注射劑輸液反應(yīng)原因分析及應(yīng)對策略[J]．中華全科醫(yī)學(xué)，2010，8（2）:204－205．

[7]田 軍，郝博濟．抗高血壓藥物靶標及劑型的研發(fā)進展[J]．中國藥房，2013，24(9):852－855．

Optimization Study on Extracting Technology of Shangkexiaozhong Granules

Li Haiying1,Liu Wu1,Liu Jicheng2

(1．First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi,China 530023; 2．Guangxi YuLin Institute for Food and Drug Control,Yulin,Guangxi,China 537000)

Objective To optimize the extracting technology conditions of shangkexiaozhong Granules．M ethods Orthogonal design was used to optimize the extraction conditions,with the content of multi－target ingredients such as the extraction of volatile oil,total solid, content of paeoniflorin and chlorogenic acid as comprehensive evaluation indexes．Results The optimum extraction conditions were as follows:take a certain amount of mint extract with water;the volatile oil content was 75．3% by this way;take the mint medical and the other 14 medicinal materials extracted with water for 2 times,the extraction percentage of Paeoniflorin and chlorogenic acid were 79．8% and 83．3%;the quantity of dry paste was 16．49 g per formula;then concentrated water－decocted liquid to be 1．15 on relative density;added ethanol to 60% (g／g);then kept them to be in cold storage and standing by 12 h;reduced pressure and concentrated the supernatant,with the rate of transfer－remaining were 80% and 74%,and the quantity of dry paste was 10．01 g per formula．Conclusion The Optimization of extraction process is simple,stable and feasible．The results provide the scientific experimental basis for determining the technology conditions of Shangkexiaozhong Granules．

Shangkexiaozhong Granules;Orthogonal Test;extracting process

TQ461；R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)01－0013－05

李海英（1979－），女，漢族，主管藥師，主要從事藥理學(xué)研究，（電子信箱）841733449＠qq．com；劉武（1964－），男，漢族，博士研究生，教授，主要從事中醫(yī)骨傷臨床研究，本文通訊作者，（電子信箱）dawu6465＠126．com。

2015－07－28)

*2013年廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中壯瑤藥制劑研發(fā)類課題，項目編號：GZZJ13－07。