高糖對(duì)腎小管細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及花青素的干預(yù)研究

杜春陽(yáng)，史永紅，朱　艷，任韞卓，吳海江，韋金英，吳　明，肖　夏，段惠軍

(河北醫(yī)科大學(xué)1．病理學(xué)教研室、2．電鏡室，河北石家莊　050017)

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高糖對(duì)腎小管細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及花青素的干預(yù)研究

杜春陽(yáng)1，史永紅1，朱艷2，任韞卓1，吳海江1，韋金英1，吳明1，肖夏1，段惠軍1

(河北醫(yī)科大學(xué)1．病理學(xué)教研室、2．電鏡室，河北石家莊050017)

中國(guó)圖書分類號(hào): R284．1; R322．61; R329．24; R344. 81; R692. 39; R977. 6

摘要:目的觀察高糖環(huán)境中腎小管上皮細(xì)胞膽固醇代謝變化以及花青素對(duì)其干預(yù)作用。方法體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞( HK-2)，隨機(jī)分為正常糖組、高糖組、甘露醇組、花青素1( C3G)干預(yù)組及花青素2( Cy)干預(yù)組。采用MTT法觀察花青素對(duì)細(xì)胞活力的影響; Amplex Red熒光法和Filipin染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外膽固醇水平; RT-qPCR和Western blot檢測(cè)三磷酸腺苷結(jié)合區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1( ABCA1)的表達(dá)。結(jié)果

與正常糖組比較，高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)膽固醇蓄積，細(xì)胞上清中的膽固醇含量明顯下降; RT-qPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷結(jié)合區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1( ABCA1)的表達(dá)高糖組均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)?；ㄇ嗨?( C3G)干預(yù)組及花青素2( Cy)干預(yù)組相比較高糖組，ABCA1的蛋白和RNA表達(dá)均明顯提高，膽固醇胞內(nèi)蓄積明顯減少。結(jié)論高糖可誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞三磷酸腺苷結(jié)合區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1表達(dá)降低，導(dǎo)致膽固醇外流減少，從而造成膽固醇胞內(nèi)蓄積;花青素減少膽固醇胞內(nèi)蓄積部分可能是通過上調(diào)ABCA1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞:花青素;高糖;腎小管上皮細(xì)胞; ABCA1;膽固醇;糖尿病腎病

段惠軍( 1955－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:腎臟病理學(xué)，通訊作者，Tel: 0311-86266942，E-mail: duanhj999@163．com

糖尿病腎病是糖尿病的慢性微血管并發(fā)癥之一，越來(lái)越多的證據(jù)表明膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)通路異常造成的膽固醇外流減少在糖尿病腎病的發(fā)生中起著重要作用［1］。三磷酸腺苷結(jié)合區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1 ( ATP-binding cassette transporter 1，ABCA1)是一種以ATP為能源促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離的膽固醇和磷脂流出的整合膜蛋白，參與調(diào)節(jié)血漿膽固醇濃度、維持外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)［2］。研究顯示ABCA1表達(dá)明顯減低參與了動(dòng)脈粥樣硬化模型中泡沫細(xì)胞的形成［3］。花青素( anthocyanidin)是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，具有很強(qiáng)的清除氧自由基、抗炎、抗凋亡、降血糖、降血脂、防癌等功效［4－6］。在動(dòng)脈粥樣硬化模型中，花青素能夠上調(diào)ABCA1的表達(dá)，將沉積在血管壁內(nèi)的甘油三酯及膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至外周組織，有效的延緩動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)展［7－8］。目前，有關(guān)糖尿病狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)通路是否存在異常及花青素的干預(yù)作用研究還未見報(bào)道。本研究旨在觀察高糖環(huán)境中人腎小管上皮細(xì)胞膽固醇含量的變化及ABCA1的表達(dá)情況，并進(jìn)行花青素干預(yù)，以探討糖尿病腎病新的防治措施。

1　材料與方法

1．1材料人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2來(lái)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷( C3G，PubChem CID: 197081)、氯化矢車菊素( Cy，PubChem CID: 68247)和MTT為Sigma公司產(chǎn)品。小鼠抗ABCA1多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。膽固醇含量分析試劑盒( Amplex Red Cholesterol Assay kit)為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。Filipin染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)GenMed公司。辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司。聚偏二氟乙烯膜( PVDF)為美國(guó)Milipore公司產(chǎn)品。

1．2方法

1．2．1細(xì)胞培養(yǎng)和分組刺激實(shí)驗(yàn)HK-2細(xì)胞在低糖型DMEM完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)0. 1胎牛血清，105U·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素)中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞到達(dá)75%～85%融合后，用無(wú)血清培養(yǎng)基同步24 h。分為5組:正常糖組( 5. 6 mmol· L－1葡萄糖，N) ;正常糖+甘露醇組( 5. 6 mmol· L－1葡萄糖+ 24. 4 mmol·L－1甘露醇，M) ;高糖組( 30 mmol·L－1葡萄糖，HG) ;高糖+ C3G組( 30 mmol·L－1葡萄糖+ 50 μmol·L－1C3G，HG + C3G) ;高糖+ Cy組( 30 mmol·L－1葡萄糖+ 50 μmol·L－1Cy，HG + Cy)。于刺激24h或48 h后收集細(xì)胞觀察。

1．2．2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力HK-2細(xì)胞接種于96孔板，經(jīng)過分組刺激24 h后，洗滌細(xì)胞后每個(gè)樣品培養(yǎng)基定容為200 μL，按說(shuō)明書要求加入200 μL ( 5 g·L－1) MTT試劑，在37℃條件下孵育4h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO室溫條件下震蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)吸光度，結(jié)果表示為與對(duì)照組吸光度比值的百分比。

1．2．3 Western blot印跡檢測(cè)細(xì)胞用冰冷PBS洗2遍，加入細(xì)胞裂解液( 25 mmol·L－1Tris-HCl，10 mmol·L－1EDTA，體積分?jǐn)?shù)0. 01 NP-40，150 mmol ·L－1氯化鈉，質(zhì)量濃度1 g·L－1苯甲基磺酰氟)，冰浴1 h，4℃、14 000 r·min－1離心25 min，Lowry法測(cè)定上清液蛋白濃度。取細(xì)胞裂解蛋白50 μg，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺( SDS-PAGE)凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜; 5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入ABCA1抗體，4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗( 1∶5000稀釋)，37℃孵育1. 5 h;洗膜后加ECL試劑，ODYSSEY遠(yuǎn)紅外雙色熒光成像系統(tǒng)顯影( LLCOR Gene Company，USA奧德賽公司)。用美國(guó)UVP公司LabWorks 4. 5分析系統(tǒng)軟件對(duì)Western blot條帶進(jìn)行定量分析。

1．2．4熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TRIzol法提取細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光實(shí)時(shí)定量PCR采用20 μL反應(yīng)體系。SYBR Premix Ex TaqTMⅡ( 2 ×) 10 μL，ROX Reference Dye ( 50×) 0. 4 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物(終濃度1 μg·L－1)各0. 8 μL，雙蒸水6 μL。反應(yīng)條件為: 95℃30 s→95℃5 s→55℃30 s→72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)比較法計(jì)算基因表達(dá)相對(duì)量。采用公式2－△△Ct計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)變化。引物序列如下: ABCA1，上游引物5'-GCACTGAGGAAGATGCTGAAA-3'，下游引物5'-AGTTCCTGGAAGGTCTTGTTCAC-3'; 18s RNA，上游引物5'-GCA AGCAGGAGTATGACGAGT-3'，下游引物5'-CTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC-3'。

1．2．5 Amplex Red熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外膽固醇含量HK-2細(xì)胞接種于96孔板，經(jīng)過分組刺激24 h 或48 h后，加入50 μL Amplex Red染料，在37℃條件下避光孵育45min，酶標(biāo)儀分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外上清培養(yǎng)基中膽固醇含量。

1．2．6 Filipin染色細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被過的蓋玻片上，分組刺激24 h或48 h后，進(jìn)行filipin染色。PBS沖洗，4%多聚甲醛室溫固定30min，PBS沖洗后filipin染色1h(避光)，PBS漂洗，防淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡下照相。

2　結(jié)果

2．1花青素對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)( MTT)結(jié)果顯示，單純高糖( 30 mmol·L－1葡萄糖)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用，高糖和花青素協(xié)同作用下，隨著花青素( C3G和Cy)濃度的增高，細(xì)胞的存活率略有下降，但和正常對(duì)照組，單純高糖組之間無(wú)明顯差異。當(dāng)C3G和Cy的濃度達(dá)到100 μmol·L－1時(shí)，細(xì)胞活性受到明顯抑制( P ＜0. 05，F(xiàn)ig 1)，因此后續(xù)試驗(yàn)中花青素的濃度選為50 μmol·L－1。

Fig 1 Effects of C3G ( A) and Cy ( B) on HK-2 cell ability determined by MTT assay( n =6)

2．2花青素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞膽固醇蓄積的影響細(xì)胞內(nèi)外膽固醇含量測(cè)定結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，在刺激的24 h高糖組細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量明顯增高，持續(xù)至48 h。與高糖組相比，C3G干預(yù)組與Cy干預(yù)組腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量均明顯降低( P＜0. 05，F(xiàn)ig 2)。與此相反，高糖組細(xì)胞上清中膽固醇含量明顯下降，C3G干預(yù)組與Cy干預(yù)組細(xì)胞上清中膽固醇含量明顯高于高糖組( P＜0. 05，F(xiàn)ig 3)。Filipin染色結(jié)果同細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量檢測(cè)結(jié)果相一致( Fig 4)。

Fig 2 Effects of anthocyanins on HG-induced accumulation of cholesterol in cellular of cultured HK-2 cells ( n =6)

Fig 3　Effects of anthocyanins on HG-induced decrease of cholesterol concentration in medium of cultured HK-2 cells ( n =6)

2．3花青素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，在刺激的24 h高糖組ABCA1蛋白和mRNA表達(dá)均明顯降低，持續(xù)至48 h。與高糖組相比，C3G干預(yù)組與Cy干預(yù)組逆轉(zhuǎn)了高糖誘導(dǎo)的ABCA1蛋白和mRNA( Fig 5，6)的低表達(dá)。

Fig 4 Cholesterol mass inside the cell measured by Filipin staining( n =6)

Fig 5 Effects of anthocyanins on mRNA expression of ABCA1in HK-2 cells( n =6)

3　討論

糖尿病腎病( diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的慢性微血管并發(fā)癥之一，臨床上以持續(xù)性蛋白尿和進(jìn)行性腎功能減退并最終進(jìn)展至終末期腎功能衰竭( chronic kidney disease，CKD)為特征。自1982年，Moorhead等提出“脂質(zhì)腎毒性假說(shuō)”以來(lái)，大量的研究進(jìn)一步證實(shí)了脂代謝紊亂是造成糖尿病腎臟損傷的重要危險(xiǎn)因素［9-11］。研究提示，腎臟脂代謝紊亂嚴(yán)重程度與腎功能惡化程度成正比［12］。新近的研究證實(shí)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)通路異常造成的膽固醇外流減少在糖尿病腎病的發(fā)生中也起著重要作用。高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞和急性腎損傷動(dòng)物模型中均出現(xiàn)膽固醇明顯蓄積，加重了腎臟病變［13－14］。我們用高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞24 h后也出現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯增高的現(xiàn)象，同時(shí)，細(xì)胞外的膽固醇含量明顯下降，提示高糖導(dǎo)致腎小管細(xì)胞膽固醇外流明顯減低。

Fig 6 Effects of anthocyanins on protein expression of ABCA1in HK-2 cells( n =6)

三磷酸腺苷結(jié)合區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1( ATP-binding cassette transporter 1，ABCA1)是一種以ATP為能源，通過載脂蛋白A-I依賴途徑促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離的膽固醇和磷脂流出的整合膜蛋白，在調(diào)節(jié)血漿膽固醇濃度、維持外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。研究顯示，在巨噬細(xì)胞中上調(diào)ABCA1的表達(dá)，通過載脂蛋白A-I依賴途徑促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離的膽固醇外流，從而減少泡沫樣細(xì)胞的形成并防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［15］。Ozasa等［3］通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，應(yīng)用PPARγ激活劑吡格列酮可增強(qiáng)ABCA1的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇外流。本實(shí)驗(yàn)中高糖刺激腎小管細(xì)胞24 h后ABCA1的RNA和蛋白水平均明顯降低，進(jìn)一步印證了高糖可以引起腎小管細(xì)胞膽固醇外流減少，造成膽固醇的過量蓄積。

花青素，又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬酚類化合物中的類黃酮類( flavonoids)。在自然界有超過300種不同的花青素，它們廣泛存在于我們的日常普通飲食的水果和蔬菜中，如紫甘薯、越橘、紫玉米、藍(lán)莓、葡萄、黑加侖、紫胡羅卜和紅甘藍(lán)等。最早在《明外史·本傳》中就有關(guān)于“常食藍(lán)莓潤(rùn)目”的記載，1947年由法國(guó)科學(xué)家馬斯魁勒提取并命名這種物質(zhì)，此后，花青素對(duì)于人體的潛在的保護(hù)作用引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。目前研究發(fā)現(xiàn)，花青素除了具有很強(qiáng)的清除氧自由基的功效之外，還具有抗炎、抗凋亡、降血糖降血脂防癌等作用［4－6］。在動(dòng)脈粥樣硬化模型中，花青素通過PPARγ-LXRa信號(hào)通路上調(diào)ABCA1的表達(dá)，將沉積在血管壁內(nèi)的甘油三酯及膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至外周組織，有效的延緩動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)展［7－8］。Takikawa等［16］用富含花青素的山桑子提取物飼喂II型糖尿病模型KK-Ay小鼠發(fā)現(xiàn)，通過飲食攝取到的花青素可以有效地改善小鼠的高血糖和高胰島素抵抗的癥狀。同樣在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，花青素有效地改善了腎臟的高糖狀態(tài)，通過抑制腎小球炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)延緩了腎臟疾病的進(jìn)展［17－18］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示花青素可以明顯上調(diào)腎小管細(xì)胞ABCA1的表達(dá)，通過ABCA1的轉(zhuǎn)運(yùn)改善高糖導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積，為糖尿病腎病的防治提供了新的治療策略。

綜上所述，花青素可以將高糖誘導(dǎo)的蓄積在腎小管細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到外周組織，從而發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用，這部分作用主要通過上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞膜上ABCA1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

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◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

Effect of high glucose on cholesterol efflux in renal tubular cell and intervention of anthocyanins

DU Chun-yang1，SHI Yong-hong1，ZHU Yan2，REN Yun-zhuo1，WU Hai-jiang1，WEI Jin-ying1，WU Ming1，XIAO Xia1，DUAN Hui-jun1
( 1．Dept of Pathology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China; 2．Dept of Electron Microscope，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China)

Abstract:AimTo investigate the effects of high glucose on cholesterol metabolism in renal tubular cells and the intervention of the anthocyanins．Methods HK-2 cells were grown in the DMEM medium supplemented with 10% FBS and were divided into 5 groups: normal glucose group，high glucose group，mannitol group，C3G group and Cy group．Effect of anthocyanins on cell viability was detected with MTT，and cholesterol accumulation was detected with Amplex Red Cholesterol Assay kit and Filipin staining．Expression of ABCA1 was detected with RT-qPCR and Western Blot．Results In compared with control groups，HG significantly promoted cholesterol mass inside the cell and decreased the cholesterol concentration in the medium after treatment for 24 h or 48 h．The levels of mRNA and protein of ABCA1 were detected with RT-qPCR and Western blot，and both were decreased in the presence of HG．Whereas treatment with C3G and Cy markedly attenuated HG-induced cholesterol mass inside the cell by up-regulating the expression of ABCA1．Conclusions High glucose can reduce the expressions of the ABCA1，and then decrease cholesterol efflux and increase the cholesterol accumulation in HK-2 cells．Anthocyanins can decrease cholesterol accumulation by up-regulating the expression of ABCA1．

Key words:anthocyanins; high glucose; tubular epithelial cells; ABCA1; cholesterol; diabetic nephropathy

作者簡(jiǎn)介:杜春陽(yáng)( 1980－)，女，博士生，講師，研究方向:腎臟病理學(xué)，Tel: 0311-86265724，E-mail: duchunyang55@163．com;

基金項(xiàng)目:河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃( No 20150628) ;河北醫(yī)科大學(xué)研究生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目;河北醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目資助的課題

收稿日期:2015－09－22，修回日期: 2015－11－22

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978( 2016) 01－0114－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．024